Método para investigar objetos nanométricos utilizando microscopía holográfica.

Método de detección de un objeto tridimensional a través de un microscopio holográfico,

siendo dicho objeto tridimensional de menor tamaño que la resolución óptica del microscopio holográfico, el cual método está compuesto por los siguientes pasos:

- proporcionar una fuente lumínica que produce un primer haz lumínico (1), siendo dicha luz al menos parcialmente coherente;

- dividir este primer haz lumínico (1) en un haz objeto (2) y un haz de referencia (6) a través de un divisor del primer haz (BS1);

- producir una imagen de la fuente lumínica en el plano de la imagen de la fuente lumínica a través de un primer objetivo de microscopio (L1), en el camino óptico del haz objeto (2) donde, por resolución óptica del microscopio holográfico, se entiende la resolución óptica de dicho primer objetivo de microscopio.

- colocar el objeto tridimensional que debe ser detectado en una celda objeto (3) en el camino óptico del haz objeto (2), entre el referido divisor del primer haz (BS1) y el referido primer objetivo de microscopio (L1);

- recombinar el haz objeto (2) y el haz de referencia (6) en un haz recombinado (8) a través de medios ópticos;

- colocar un tope óptico (4) en el plano de la imagen de la fuente lumínica del referido objetivo de microscopio (L1), sobre el eje óptico de dicho objetivo de microscopio (L1), dicho tope óptico (4) se coloca de tal manera que, sin el objeto tridimensional, el haz objeto es bloqueado;

- enfocar en un medio de registro (5) el haz recombinado (8) a través de un medio de enfoque (L3);

- registrar las señales interferométricas producidas por la interacción entre el haz de referencia y el haz objeto con un medio de registro (5),

- reconstruir una imagen tridimensional del objeto tridimensional que se detectará a través de la referida señal interferométrica, detectando así dicho objeto tridimensional.

Método para investigar objetos nanométricos utilizando microscopía holográfica.

Campo de la invención La presente invención está relacionada con un microscopio holográfico y un método para investigar objetos nanométricos.

Antecedentes de la invención La microscopía holográfica digital (MHD) , donde el holograma se graba con una cámara CCD, constituye una herramienta eficaz para reenfocar, corte tras corte, las imágenes de profundidad de una muestra gruesa a través de la reconstrucción digital. La MHD también brinda imágenes de contraste de fase cuantitativa con numerosas aplicaciones como el estudio de muestras biológicas. La capacidad de reconstrucción en profundidad hace que la MHD sea muy poderosa para implementar la velocimetría tridimensional. Como la holografía digital brinda la amplitud compleja, se implementaron procesos poderosos, como el enfoque automatizado, la compensación por aberración, el reconocimiento de patrones tridimensionales, el procesamiento de segmentación y de bordes. La capacidad de la MHD para registrar, en un corto tiempo, el volumen de información que puede seguir siendo procesado posibilita la investigación de fenómenos rápidos con distorsiones temporales reducidas. Esta es una ventaja decisiva en aplicaciones de velocimetría tridimensional. Con este propósito, se investigaron distintos enfoques, incluido el uso de holografía en línea. En configuraciones de campo brillante, cabe esperar reconstrucciones contrastadas de partículas por MHD cuando el tamaño de las partículas exceda la resolución del sistema. Aun así, en algunas circunstancias, esta condición es difícil de cumplir debido a consideraciones prácticas. En el caso de las partículas con tamaños inferiores al micrón, el uso de lentes de alta apertura numérica es frecuentemente poco realista debido a la pequeña distancia de trabajo y, en algunos casos, debido al uso de lentes de inmersión en aceite. Más aun, con el uso creciente de objetos nanométricos para numerosas aplicaciones, existen casos en que las partículas que queremos detectar son de menor tamaño que el límite de resolución óptica el cual es de aproximadamente 300 nm. Por lo tanto, es necesario que los sistemas ópticos puedan detectar rápidamente partículas u objetos menores al límite de resolución de la microscopía óptica.

En la tesis doctoral de J.A. Domínguez Caballero “Toma de imágenes digitales holográficas de especies acuáticas”, se divulga un sistema de imágenes holográficas de campo oscuro. El sistema divulgado no da ningún indicio acerca de la optimización de la detección de objetos de menor tamaño que la resolución del sistema óptico.

Objetivos de la invención El objetivo de la invención consiste en brindar un método de detección de un objeto tridimensional a través de un microscopio holográfico que mejore los métodos de las técnicas anteriores.

Más particularmente, la invención intenta brindar un método de operación de un microscopio holográfico de transmisión (MH) para detectar objetos tridimensionales de menor tamaño que el límite de resolución típico de la microscopía óptica (300 nm) .

Compendio de la invención La invención está relacionada con un método para detectar un objeto tridimensional por medio de un microscopio holográfico, siendo dicho objeto tridimensional menor que la resolución óptica del microscopio holográfico; el método comprende los siguientes pasos:

- Proporcionar una fuente lumínica que produzca un primer haz, siendo dicha fuente lumínica al menos parcialmente coherente;

- Dividir dicho primer haz en un haz objeto y un haz de referencia a través de un divisor del primer haz;

- Producir una imagen de la fuente lumínica en un plano de la imagen de la fuente lumínica a través de un primer objetivo de microscopio, en el camino óptico del haz objeto;

- Colocar el objeto tridimensional que se pretende detectar en una celda objeto en el camino óptico del haz objeto, entre el referido divisor del primer haz y el referido primer objetivo del microscopio;

- Recombinar el haz objeto y el referido haz de referencia para formar un haz recombinado a través de medios ópticos;

- Colocar un tope óptico en el referido plano de la imagen de la fuente lumínica del objetivo del microscopio en el eje óptico de dicho objetivo.

-Enfocar el referido haz combinado en los referidos medios de registro con los medios de enfoque;

-Registrar las señales interferométricas producidas por la interacción entre el haz de referencia y el haz objeto 5 a través de un medio de registro,

- reconstruyendo una imagen tridimensional del objeto tridimensional que se pretende detectar a partir de la referida señal interferométrica, detectando de esta manera el referido objeto tridimensional.

Por imagen tridimensional, se entiende la representación tridimensional del objeto tridimensional.

Por resolución óptica (RO) del microscopio holográfico, se entiende la resolución óptica del primer objetivo del microscopio. La resolución óptica se define como la capacidad de un sistema de imágenes para determinar detalles en el objeto cuya imagen se está captando. Se utiliza el criterio de Rayleigh en la descripción actual, el cual

representa la menor distancia entre dos puntos en el plano del objeto que es distinguible en el plano de la imagen. Para microscopios, se puede estimar según la fórmula RO=0, 61·A/AN, donde AN es la apertura numérica del objetivo y A es la longitud de onda de la luz.

De acuerdo con realizaciones preferidas específicas, el método de la invención actual divulga una combinación 20 adecuada de las siguientes características o al menos una de ellas:

- El tope óptico es mayor que el tamaño de la imagen de la fuente lumínica en el plano de la imagen de la fuente lumínica del referido objetivo del microscopio;

- El método incluye el paso de insertar un atenuador óptico en el camino óptico del haz de referencia;

- Los medios ópticos se componen de lo siguiente:

• Un segundo divisor de haz; 30 • Un primer espejo ubicado para dirigir el haz de referencia hacia el mencionado segundo divisor de haz;

• Un segundo espejo ubicado para dirigir el haz objeto hacia el mencionado segundo divisor de haz;

- La función de transferencia óptica del camino óptico del haz objeto sin el espécimen y sin el tope óptico y del haz de referencia sin el atenuador óptico son esencialmente equivalentes. En la presente invención, por

función de transferencia óptica se entiende una función que aplicada a la fase y la amplitud en un plano de entrada, calcula la fase y la amplitud en un plano de salida.

- La longitud total del camino óptico tanto del haz objeto como del haz de referencia son esencialmente iguales.

- El método comprende el paso de compensar la diferencia de caminos ópticos entre el haz de referencia y el haz objeto, y de producir, en ausencia del espécimen y del tope óptico, esencialmente la misma dependencia de fase espacial del haz objeto y del haz de referencia en los medios de registro;

-El método comprende el paso de insertar un segundo objetivo de microscopio en el camino óptico del referido 45 haz de referencia;

- Una celda de referencia similar a la celda objeto pero que no incluya el espécimen que se estudiará, o un material transparente de un adecuado grosor y una adecuada composición se inserta en el camino óptico del haz de referencia, preferentemente cerca del plano focal frontal del referido segundo objetivo de microscopio;

- La fuente lumínica es parcialmente coherente espacialmente;

- La fuente lumínica es parcialmente coherente temporalmente;

- El medio de registro es una cámara de vídeo, preferentemente, dicha cámara de vídeo es una cámara CCD o CMOS.

- La cámara de vídeo está conectada a medios de procesamiento y de análisis de imagen computarizados para

procesar las referidas señales interferométricas; 60

- La reconstrucción de la imagen tridimensional se obtiene volviendo a enfocar corte tras corte el volumen experimental en el cual el objeto tridimensional se encuentra distribuido para poder reconstruir una imagen tridimensional.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 representa a un microscopio holográfico de campo oscuro de acuerdo con esta invención.

La figura 1a representa una imagen de intensidad de campo brillante registrada en foco de acuerdo con la tecnología anterior (zona de 100x100 recortada de la imagen original)

La figura 1b representa una imagen de intensidad de campo oscuro registrada en foco. La... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de un objeto tridimensional a través de un microscopio holográfico, siendo dicho objeto tridimensional de menor tamaño que la resolución óptica del microscopio holográfico, el cual método está compuesto por los siguientes pasos:

- proporcionar una fuente lumínica que produce un primer haz lumínico (1) , siendo dicha luz al menos parcialmente coherente;

- dividir este primer haz lumínico (1) en un haz objeto (2) y un haz de referencia (6) a través de un divisor del primer haz (BS1) ;

- producir una imagen de la fuente lumínica en el plano de la imagen de la fuente lumínica a través de un

primer objetivo de microscopio (L1) , en el camino óptico del haz objeto (2) donde, por resolución óptica del microscopio holográfico, se entiende la resolución óptica de dicho primer objetivo de microscopio.

- colocar el objeto tridimensional que debe ser detectado en una celda objeto (3) en el camino óptico del haz objeto (2) , entre el referido divisor del primer haz (BS1) y el referido primer objetivo de microscopio (L1) ;

- recombinar el haz objeto (2) y el haz de referencia (6) en un haz recombinado (8) a través de medios ópticos;

- colocar un tope óptico (4) en el plano de la imagen de la fuente lumínica del referido objetivo de microscopio

(L1) , sobre el eje óptico de dicho objetivo de microscopio (L1) , dicho tope óptico (4) se coloca de tal manera 25 que, sin el objeto tridimensional, el haz objeto es bloqueado;

- enfocar en un medio de registro (5) el haz recombinado (8) a través de un medio de enfoque (L3) ;

- registrar las señales interferométricas producidas por la interacción entre el haz de referencia y el haz objeto con un medio de registro (5) ,

- reconstruir una imagen tridimensional del objeto tridimensional que se detectará a través de la referida señal interferométrica, detectando así dicho objeto tridimensional.

2. El método de la reivindicación 1 en el cual el referido tope óptico (4) es de mayor tamaño que el de la imagen de la fuente lumínica en el plano de la imagen de la fuente lumínica del referido objetivo de microscopio (L1) .

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que consiste en insertar un atenuador óptico (7) en el camino óptico del haz de referencia (6) .

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual el referido medio óptico está compuesto por:

-un segundo divisor de haces (BS2) ; 45

- un primer espejo (M1) ubicado para dirigir el haz de referencia (6) hacia el referido segundo divisor de haces (BS2) ;

- un segundo espejo (M2) ubicado para dirigir el haz objeto (2) hacia el referido segundo divisor de haces (BS2) .

5. El método de la reivindicación 3 o 4, cuando depende de la reivindicación 3, en el cual la función de transferencia óptica del camino óptico del haz objeto (2) sin el objeto tridimensional (9) y sin el tope óptico (4) , y la del haz de referencia (6) sin el atenuador óptico (7) son esencialmente equivalentes.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la longitud total del camino óptico del haz objeto (2) y del haz de referencia (6) son esencialmente iguales.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que consiste en compensar la diferencia de caminos ópticos entre el haz de referencia y el haz objeto, para producir, en ausencia del objeto tridimensional (9) y del tope óptico (4) , esencialmente la misma dependencia de fase espacial del haz objeto y el haz de referencia en el medio de registro.

8. El método de la reivindicación 7 en el cual el paso de compensar la diferencia de camino óptico entre el haz de

referencia y el haz objeto resulta de insertar un segundo objetivo de microscopio (ML2) en el camino óptico del referido haz de referencia (6) .

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en el cual una celda de referencia similar a la celda objeto (3) , pero que no incluye al objeto tridimensional (9) que se estudiará, o un material transparente de grosor y de composición apropiados, se inserta en el camino óptico del haz de referencia.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la referida fuente lumínica es parcialmente coherente espacialmente.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la antemencionada fuente lumínica es 10 parcialmente coherente temporalmente.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual el referido medio de registro es una cámara de vídeo (5) .

13. El método de la reivindicación 12 en el cual dicha cámara de vídeo (5) es una cámara CCD o CMOS.

14. El método de la reivindicación 12 o 13 en el cual la cámara de vídeo (5) se conecta a medios de procesamiento y de análisis de imagen computarizados para procesar las referidas señales interferométricas.