Conversión mejorada de ADN con bisulfito.

Un procedimiento para la conversión de ADN con bisulfito, en el que se hace reaccionar ADN genómico aisladocon un reactivo de bisulfito,

caracterizado porque la reacción se realiza a una temperatura en el intervalo de 0-80ºC, y porque la temperatura de la reacción aumenta hasta un intervalo de 85-100ºC brevemente durante elcurso de la conversión (termopicos), llegando a ser el número de incrementos de temperatura de corta duración(termopicos) de 1 a 10.

Conversión mejorada de ADN con bisulfito

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de mutilaciones de citosina en el ADN. La 5metilcitosina es la base covalentemente modificada más frecuente en el ADN de las células eucarióticas. Por ejemplo, desempeña un papel en la regulación de la transcripción, en la impresión genética y en la tumorigénesis (para una revisión: Millar y col.: Five not four: Histor y and significance of the fifth base. En: S. Beck y A. Olek, eds.: The Epigenome. Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3 20) . Por tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de la información genética es de un interés considerable. No obstante, las posiciones de 5-metilcitosina no se pueden identificar mediante secuenciación porque la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de pares de bases que la citosina. Además, en el caso de una amplificación por PCR, la información epigenética, portada por las 5-metilcitosinas, se pierde completamente.

Los procedimientos habituales para el análisis de la metilación operan esencialmente de acuerdo con dos principios diferentes. O se utilizan encimas de restricción específicas de metilación o se realiza una conversión química selectiva de citosinas no metiladas en uracilo (tratamiento con bisulfito) . A continuación, el ADN enzimática o químicamente pre-tratado se amplifica y se puede analizar de diferentes modos (para revisión: Fraga y Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33:632-649, Sept. 2002) WO 02/072880 pp. 1 ff) .

Dado que el uso de enzimas específicas de metilación está restringido a ciertas secuencias que contienen sitios de restricción reconocidos por dichas enzimas, para la mayoría de las aplicaciones se realiza un tratamiento con bisulfito (para revisión: documento US 10/311.611) . De acuerdo con la invención, una “reacción con bisulfito”, “tratamiento con bisulfito” o “procedimiento con bisulfito” deberá querer decir una reacción para la conversión de bases de citosina en un ácido nucleico en bases de uracilo en presencia de iones bisulfito según la cual las bases de 5-metilcitosina no se convierten significativamente. La reacción con bisulfito contiene una etapa de desaminación y una etapa de desulfonación que se pueden realizar por separado o simultáneamente (en el documento EP 1394172A1 se describen otros detalles y se muestra un esquema de reacción) . Hay varios documentos que abordan aspectos específicos de la reacción con bisulfito, incluidos Hayatsu y col., Biochemistr y 9 (1970) 2858 28659; Slae y Shapiro, J.Org. Chem. 43 (1978) 4197-4200; Paulin y col., Nucl. Acid Res. 26 (1998) 5009-5010; Raizis y col., Anal Biochem. 226 (1995) , 161-1666; Wang y col. Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4777-4790. Estos documentos se resumen en el documento EP 1394172A1.

Normalmente, el tratamiento con bisulfito se realiza del siguiente modo: El ADN genómico se aísla, fragmenta mecánica o enzimáticamente, desnaturaliza con NaOH, convierte varias horas mediante una solución concentrada de bisulfito y, por último, desulfona y desala (p. ej.: Frommer y col.: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1; 89 (5) :1827-31) .

En los últimos tiempos se han desarrollado varias mejoras técnicas de los procedimientos con bisulfito. El procedimiento con perlas de agarosa incorpora el ADN que se va a investigar en una matriz de agarosa, a través de la cual se previene la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con ADN monocatenario) y todas las etapas de precipitación y purificación se sustituyen con diálisis rápida (Olek A. y col. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis, Nucl. Acid Res. 1996, 24, 5064-5066) . En la solicitud de patente WO 01/98528 (= DB 100 29 915; = solicitud de EE.UU. 10/311.661) se describe una conversión con bisulfito en la que la muestra de ADN se incuba con una solución de bisulfito de un intervalo de concentraciones entre 0, 1 mol/l a 6 mol/l en presencia de un reactivo de desnaturalización y/o un disolvente y al menos un secuestrante. En dicha solicitud de patente se describen varios reactivos desnaturalizantes y secuestrantes adecuados (documento incorporado al presente documento por referencia en su totalidad) . En la solicitud de patente WO 03/038121 (=DE 101 54 317; =10/416, 624) se desvela un procedimiento en el que el ADN a analizar está unido a una superficie sólida durante el tratamiento con bisulfito. En consecuencia se facilitan las etapas de purificación y lavado. Más mejoras se describen en las solicitudes de patente EP1394173A1 y EP1394172A1.

No obstante, un problema básico del tratamiento con bisulfito consiste en el hecho de que son necesarios tiempos de reacción largos con el fin de garantizar una conversión completa y de excluir resultados falsos positivos. Sin embargo, simultáneamente, esto conduce a una degradación del ADN debido a los tiempos de reacción prolongados. De hecho, temperaturas de reacción más elevadas conducen a una tasa de conversión superior, y también a una degradación más intensa del ADN. Recientemente se han investigado sistemáticamente las interacciones entre temperatura, tiempo de reacción, tasas de conversión y degradación De este modo se ha podido mostrar que los índices de conversión más elevados se alcanzaron a temperaturas de 55ºC (con tiempos de reacción entre 4 y 18 horas) y a 95 ºC (con un tiempo de reacción de una hora) . No obstante, un problema serio es la degradación del ADN durante este procedimiento. A una temperatura de reacción de 55 ºC, el 84-96% del ADN se descompone. A 95ºC la degradación es, de hecho, incluso mayor (Grunau y col. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1; 29 (13) :E65-5) . Por tanto, la mayoría de los autores usan temperaturas de reacción de aproximadamente 50 ºC (véase Froromer y col., loc. cit.

1992, p. 1827; Olek y col., loc. cit. 1996, p. 5065; Raizis y col.: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20; 226 (1) :161-6, 162) .

Además del elevado índice de degradación del ADN existe otro problema en los procedimientos convencionales con bisulfito, que consiste en el hecho de que todavía no se ha descrito un potente procedimiento de purificación para ADN convertido. Muchos autores usan precipitaciones (véase Grunau y col., loc. cit.) . También se ha descrito una purificación mediante superficies de unión a ADN (véase: Kawakami y col.: Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, N.º. 22, 2000, pp. 1805-11) . No obstante, el rendimiento de estas purificaciones es limitado.

Debido a las elevadas pérdidas del tratamiento con bisulfito convencional, el uso de estos procedimientos supone un problema en las investigaciones en las que la cantidad de ADN a analizar es limitada. No obstante, un campo del análisis de la metilación particularmente interesante reside en el diagnóstico de las enfermedades cancerosas u otros trastornos asociados con una variación en el estado de la metilación por medio del análisis del ADN de los fluidos corporales, por ejemplo de sangre u orina. Sin embargo, en los fluidos corporales el ADN sólo está presente a concentraciones bajas, por lo que la aplicabilidad del análisis de la metilación está limitada por el bajo rendimiento del tratamiento convencional con bisulfito.

En consecuencia, sobre la base de la particular importancia del análisis de la metilación de la citosina y según las desventajas descritas de la metodología convencional, existe una gran necesidad de mejores procedimientos de la conversión con bisulfito.

La invención está caracterizada por las reivindicaciones adjuntas. Por otra parte en la actualidad se ha descubierto que la adición de ciertos disolventes desnaturalizantes incrementa el índice de conversión de la reacción con bisulfito de un modo inesperado y sorprendente. De forma simultánea se reduce el tiempo de reacción necesario y, en consecuencia, el índice de degradación. Aunque el uso de disolventes desnaturalizantes ya se conoce en la técnica actual, el experto en la técnica no esperaba que los disolventes seleccionados en esta invención causaran un efecto tan fuerte. Además de un índice de conversión claramente mejorado y de la reducción del índice de degradación, el uso de dicho disolvente conduce a otra ventaja importante. Normalmente,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la conversión de ADN con bisulfito, en el que se hace reaccionar ADN genómico aislado con un reactivo de bisulfito, caracterizado porque la reacción se realiza a una temperatura en el intervalo de 080ºC, y porque la temperatura de la reacción aumenta hasta un intervalo d.

8. 100ºC brevemente durante el

curso de la conversión (termopicos) , llegando a ser el número de incrementos de temperatura de corta duración (termopicos) de 1 a 10.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque el número de incrementos de la temperatura de duración breve (termopicos) asciende de 2 a 5.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque durante los incrementos de

la temperatura de duración breve (termopicos) la temperatura de reacción aumenta a 85 a 100 ºC, o a 90 a 98 ºC., alternativamente.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ADN convertido se purifica a través de partículas magnéticas, filtración de gel, superficies de unión a ADN o ultrafiltración.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ADN convertido se analiza 15 mediante uno de los siguientes procedimientos: MSP, Heavy Methyl, MsSNuPE, Methyl Light.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque además se investiga ADN de muestras de tejido o de fluidos corporales.

7. Uso de un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para el diagnóstico y/o pronóstico de acontecimientos adversos para pacientes o individuos, según los cuales estos acontecimientos adversos 20 pertenecen a al menos una de las categorías siguientes: interacciones farmacológicas indeseadas; enfermedades cancerosas; malfunciones, daños o enfermedades del SNC; síntomas de agresividad o alteraciones de la conducta; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales del daño cerebral; alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedades, malfunción y daños cardiovasculares; malfunción, daños o enfermedad del tracto gastrointestinal; malfunción, daños o

enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; malfunción, daños o enfermedad del cuerpo como anomalía en el proceso del desarrollo; malfunción, daño o enfermedad de la piel, los músculos o el tejido conjuntivo o de los huesos; malfunción, daños o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de cabeza o malfunción sexual.

8. Uso de un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para distinguir tipos de células o tejidos o para 30 investigar la diferenciación celular.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha reacción se lleva a cabo en presencia de un compuesto del grupo de dioxano, uno de sus derivados y un éter cíclico alifático similar.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha reacción se lleva a cabo en presencia de un compuesto con la fórmula siguiente:

n = 1-35000

m = 1-3 R1 = H, Me, Et, Pr, Bu R2 = H, Me, Et, Pr, Bu