Complejos multiméricos de antígenos y C4bp.

Dominio C4bp capaz de formar multímeros y que tiene al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidoscon SEC ID no: 1.

Complejos multiméricos de antígenos y C4bp.

Campo de la invención Esta invención se refiere a ensamblajes macromoleculares, tales como proteínas de fusión, que comprenden un adyuvante y un antígeno, ensamblajes los cuales provocan una respuesta inmunitaria potenciada frente al antígeno en comparación con el antígeno solo.

Antecedentes de la invención Se necesitan métodos mejorados de inmunización tanto para mejorar las vacunas actuales como para crear unas nuevas. Al mismo tiempo, existe la necesidad de minimizar o evitar el uso de adyuvantes, ya que sólo se ha dado a conocer un número muy limitado para uso en seres humanos, y hay un deseo muy extendido de minimizar su uso en animales, a fin de reducir el sufrimiento animal.

Las solicitudes de patentes recientes describen el uso de dominios de oligomerización C4bp de mamíferos para incrementar la inmunogenicidad de antígenos en mamíferos. Estas solicitudes incluyen los documentos PCT/IB2004/002717 y PCT/EP03/08926. Una patente previa, WO 91/11461, explicó el uso de proteínas de fusión de C4bp para la inmunización, pero no se demostraron inmunizaciones exitosas. El documento PCT/EP03/08928 describe métodos para producir las proteínas de fusión de C4bp de mamíferos. Sin embargo, hasta la fecha, no se conoce ningún dominio de oligomerización C4bp para una especie no mamífera. Puesto que hay un considerable interés en la vacunación de especies no mamíferas, por ejemplo de pájaros frente a la gripe aviar, sería de utilidad considerable un dominio de oligomerización C4bp derivado de tales especies.

Oshiumi et al. (2005 J. Immunol. 175, 1724-1734) han caracterizado el regulador del locus de activación del complemento en el pollo, y han identificado tres proteínas que denominaron CREM, CREG y CRES. Se caracterizaron los transcritos de cada gen, permitiendo que se dedujeran las secuencias proteicas completas. Una de estas proteínas, CRES, se describió como el gen C4bp del pollo.

Sumario de la invención Se ha encontrado una nueva secuencia proteica codificada por una secuencia de ADN también encontrada en el locus de RCA del pollo, pero distinta de cualesquiera de las secuencias descritas por Oshiumi et al. La secuencia de ADN de 189 nucleótidos y el dominio proteico de 62 aminoácidos que codifica se muestran en la figura 1. Se hace referencia a este dominio como el dominio de oligomerización C4bp del pollo.

La presente invención proporciona así un producto que comprende:

un primer componente de un dominio C4bp capaz de formar multímeros y que tiene al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID no: 1; y

un segundo componente de un antígeno.

Los componentes primero y segundo pueden estar en forma de una proteína de fusión. En una alternativa, pueden estar acoplados químicamente, a través de una cadena lateral de aminoácidos del primer componente o a través de la cadena lateral de un aminoácido que se ha añadido al primer componente específicamente para permitir el acoplamiento químico del segundo componente.

Los componentes primero y segundo también pueden estar asociados de forma no covalente entre sí. Por ejemplo, la cadena lateral de un aminoácido del primer componente se puede modificar para que tenga un grupo biotina adicional, y esta biotina se puede usar para combinarla con estreptavidina (en el que la estreptavidina es el segundo componente) , o se puede combinar un antígeno fusionado a estreptavidina con el primer componente a través de esta biotina. En otra posibilidad, el antígeno biotinilado y el primer componente biotinilado se pueden mantener juntos firmemente pero de forma no covalente añadiendo estreptavidina y purificando los complejos que resultan. Estos ejemplos de asociación no covalente son meramente ilustrativos, y los expertos en la técnica entenderán que se pueden utilizar otros tipos de asociación no covalente, que conducen de forma deseable a una unión no covalente fuerte de los dos componentes.

Para evitar dudas, la designación de componentes “primero” y “segundo” no implica o indica un orden lineal específico en el producto de los dos componentes. Los dos componentes se pueden unir en cualquier orden. Aunque en un aspecto preferido el producto comprenderá los componentes primero y segundo en una relación 1:1, también está dentro del alcance de la invención que más de un primer componente se puede asociar con un segundo componente, o viceversa. Por ejemplo, la relación de un primer a un segundo componente puede ser 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1 o 4:1. Cuando la relación es distinta de 1:1, se prefiere un exceso de segundo componente.

De este modo, cuando ambos componentes son polipéptidos y el producto se obtiene como una proteína de fusión, el orden N- a C-terminal de los dos componentes puede ser en cualquier permutación.

La invención proporciona además ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de dichos componentes primero y segundo. La invención también proporciona vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y células hospedantes que poseen dichos vectores.

En otra realización, la invención proporciona un método para obtener un producto que comprende:

un primer componente de un dominio C4bp capaz de formar multímeros y que tiene al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID no: 1; y

un segundo componente de un antígeno polipeptídico,

comprendiendo el método expresar ácido nucleico que codifica los dos componentes en forma de una proteína de fusión, y recuperar el producto.

Los métodos para obtener el producto se pueden llevar a cabo en células eucariotas o procariotas.

La invención también proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria frente a un antígeno, método el cual comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un producto según la invención.

La invención también proporciona el producto de la invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo 25 humano o animal, particularmente un método para inducir una respuesta inmunitaria.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un producto de la invención en asociación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además un método para preparar un suero inmunitario protector para uso en la inmunización pasiva frente a un agente infeccioso, comprendiendo dicho método vacunar a un sujeto animal, incluyendo un ser humano, con un producto de la invención, y recuperar antisuero de dicho animal, incluyendo un ser humano. El antisuero se puede usar entonces en un método de inmunización pasiva de un sujeto. El sujeto puede ser un sujeto con, o en riesgo de, infección con el agente infeccioso.

El sujeto animal puede ser particularmente un sujeto mamífero, incluyendo un ser humano. Una ventaja de la presente invención es que, aunque el producto de la invención induce anticuerpos frente al primer componente en mamíferos (tales como ratones y conejos) , estos anticuerpos no reaccionan de forma cruzada con la proteína C4bp mamífera endógena. De este modo, los productos de la invención pueden ser útiles no sólo en uso humano sino también en usos veterinarios, por ejemplo en el tratamiento de mamíferos domesticados, incluyendo ganado (por ejemplo reses, ovejas, cerdos, cabras, caballos) y mascotas (por ejemplo gatos, perros, roedores) , o en el tratamiento de mamíferos salvajes, tales como aquellos cautivos en zoológicos.

En otro aspecto, el producto de la invención se puede usar para el tratamiento de sujetos no mamíferos, incluyendo 45 aves de corral tales como pollos, pavos, patos, gansos y similares. En este aspecto, el segundo componente puede incluir un antígeno de un organismo infeccioso bacteriano o vírico, tal como un antígeno de una especie Salmonella, una especie Escherichia (particularmente E. coli) , una especie Campylobacter, un virus de la gripe, o similar.

Más abajo se discuten aquí otros ejemplos de antígenos. 50

Descripción de los dibujos La figura 1 muestra la secuencia de ADN y proteica del dominio C4bp de la invención.

La figura 2 muestra un alineamiento del dominio C4bp de la invención, el dominio C4bp putativo de CRES y C4bp humana.

La figura 3 es de un gel que muestra una proteína purificada (AVD259) de la invención.

La figura 4 muestra el comportamiento de la proteína AVD262 en un gel de SDS-PAGE en presencia y ausencia del agente reductor beta-mercaptoetanol (BME) .

Descripción detallada de la invención Dominio C4bp de SEC ID no: 1 o su variante El dominio C4bp de SEC ID no: 1 comprende 62 aminoácidos.... [Seguir leyendo]

1. Dominio C4bp capaz de formar multímeros y que tiene al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID no: 1. 5

2. Dominio C4bp según la reivindicación 1, que consiste en los restos 1-62 de SEC ID no: 1.

3. Dominio C4bp según la reivindicación 1, en el que dicho dominio C4bp es un fragmento de al menos 48

aminoácidos contiguos de SEC ID no: 1. 10

4. Dominio C4bp según la reivindicación 1, en el que dicho dominio C4bp comprende una supresión N-terminal y/o C-terminal de 1 a 8 aminoácidos de SEC ID no: 1.

5. Dominio C4bp según la reivindicación 1, en el que dicho dominio C4bp comprende de 1 a 8 sustituciones de 15 aminoácidos en el dominio C4bp de SEC ID no: 1.

6. Dominio C4bp según la reivindicación 1, en el que dicho dominio C4bp tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos SEC ID nos: 5-14, SEC ID no: 42 y SEC ID no:

43. 20

7. Producto que comprende un dominio C4bp no de mamífero como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un antígeno.

8. Producto según la reivindicación 7, en el que dicho antígeno está fusionado al término N o C de dicho dominio 25 C4bp, opcionalmente vía un enlazador flexible.

9. Producto según la reivindicación 7 u 8, en el que dicho antígeno es endógeno en seres humanos.

10. Producto según la reivindicación 9, en el que el antígeno es hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) . 30

11. Composición que comprende el producto de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, junto con un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

12. Producto según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, o la composición de la reivindicación 11, para uso 35 en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.

13. Vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de un dominio C4bp no de mamífero como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

un antígeno polipeptídico, enlazado funcionalmente a un promotor funcional en una célula hospedante.