Combinación de un dispositivo lector y una incubadora.

Disposición de detección para detectar la presencia de un analito en una muestra,

comprendiendo la disposiciónde detección:

a) un procesador,

b) una memoria,

c) un presentador visual,

d) un dispositivo de medición del color, y

e) una incubadora que comprende un dispositivo de calentamiento y una abertura para sostener una muestra, endonde el dispositivo de calentamiento está colocado dentro del dispositivo de medición del color,en donde la memoria, el presentador visual y el dispositivo de medición del color están dispuesta/os paracomunicarse con el procesador, el dispositivo de medición del color está dispuesto para generar unas señalesluminosas, enviar dichas señales luminosas a dicha muestra, recibir unas señales luminosas de retornoprocedentes de la muestra, convertir las señales luminosas de retorno en unas señales de colores y enviar lasseñales de colores al procesador, el procesador se hace funcionar mediante unas instrucciones almacenadas en lamemoria y el procesador está configurado para realizar las etapas d del método de la reivindicación 4.

Combinación de un dispositivo lector y una incubadora Campo del invento El presente invento se refiere a un nuevo sistema de ensayo mejorado y a un nuevo método para la determinación rápida de la presencia o ausencia de analitos en una muestra usando un sencillo equipo constituido por un dispositivo lector y un ordenador, combinado con un equipo de calentamiento.

Antecedentes del invento Los métodos de ensayo (sistemas de ensayo) para la detección de analitos en unas muestras son ampliamente conocidos en la especialidad. Unos ejemplos particulares de sistemas de ensayo son los de aquellos en los que el analito se ha de detectar tiene un especifico espectro de colores, rayos IR o rayos UV y por lo tanto puede ser detectado por medio de un dispositivo lector, que comprende una celda fotoeléctrica, un escáner, cualquier tipo de cámara y, desde luego, por medios visuales. Si las características espectrales del analito en cuestión no son suficientes para una detección adecuada, con frecuencia es posible usar unos métodos indirectos. Por ejemplo, están disponibles unos métodos, según los cuales la presencia del analito desencadena un proceso secundario, que luego da como resultado la formación de un producto o suceso que tiene una característica espectral específica. Éste puede ser un producto coloreado, pero también puede ser un cambio en el valor del pH, en el potencial redox, en la temperatura y en fenómenos similares, que a su vez desencadena a una molécula indicadora para cambiar el

espectro de colores, de rayos IR, de redox o de rayos UV. Se emplean en la especialidad muchos tipos de procesos secundarios para diversas aplicaciones. Por ejemplo, el documento de solicitud de patente de los EE.UU US 2004/018552 describe un dispositivo analizador microbiológico automático para determinar tanto la identidad de un microorganismo como la concentración de un antibiótico, que es efectivo para la inhibición del crecimiento del microorganismo.

Un ejemplo es una reacción química del analito con una molécula fluorescente o coloreada, que da como resultado un producto sin fluorescencia ni color o con una fluorescencia o un color diferente, o a la inversa.

Otro ejemplo es una inhibición de un proceso (bio) químico por el analito, según la que la presencia del analito es medida indirectamente como resultado de la ausencia (o presencia) del efecto de ese proceso (bio) químico. Esto último puede ser ilustrado, por ejemplo, por unos sistemas de ensayo microbiológicos para la detección de analitos, 30 particularmente de residuos de antibióticos y de agentes quimioterapéuticos, en unos fluidos tales como leche, jugo de carne, suero, orina, agua (residual) y similares. Unos ejemplos de dichos ensayos han sido descritos en los documentos de patente canadiense CA 2056581, de patente alemana DE 3613794, de patentes europeas EP 0005891, EP 0285792, EP 0611001, de patente británica GB A 1467439 y de patente de los EE.UU US 4.946.777. Estas descripciones tratan todas de ellas de unos sistemas de ensayo fáciles de usar, que hacen uso 35 de un organismo de ensayo y que darán un resultado por el cambio indicado por una molécula indicadora, por ejemplo un cambio del color de un indicador del pH y/o de redox, que se ha añadido al sistema de ensayo. Un cambio en el indicador indica la presencia de un organismo de ensayo que está creciendo. El principio consiste en que, cuando está presente un analito en un fluido en una concentración suficiente para inhibir el crecimiento del organismo de ensayo, el color del indicador seguirá siendo el mismo. En contraste, cuando no se produce ninguna 40 inhibición, el crecimiento del organismo de ensayo está acompañado por la formación de un ácido o de unos metabolitos reducidos o por otros fenómenos, que inducirán una señal indicadora. Los ensayos conocidos, más arriba mencionados, incluyen un medio de ensayo, tal como un medio de agar, inoculado con un apropiado organismo de ensayo, de manera preferible una cepa de Bacillus, Escherichia o Streptococcus, y un indicador del pH y/o un indicador de redox. El apropiado organismo de ensayo y el indicador, y opcionalmente unos tampones, 45 nutrientes, agentes tensioactivos y similares, se introducen dentro de un gel o simplemente se mantienen en solución. Normalmente, se escogen unas condiciones, de tal manera que los organismos de ensayo permanecen vivos, pero no se pueden multiplicar a causa de la falta de un requisito esencial de crecimiento (este puede ser un nutriente, un valor específico del pH o de la temperatura, o cualquier otro parámetro esencial) . En el documento de solicitud de patente internacional WO 2005/118837, por ejemplo, se describe un sistema de ensayo microbiológico 50 en el que se añade un oligosacárido al medio de ensayo.

Unos sistemas de ensayo, que requieren un régimen de temperatura más o menos estricto, para que los resultados que han de ser generados formen de una manera confiable y exacta una clase especial de métodos entre los que más arriba se han mencionado. Estos tipos de métodos requieren un equipo de incubación con el fin de mantener al sistema de ensayo a una temperatura o un perfil de temperaturas que previamente se ha determinado, durante un 55 período de tiempo dado. Usualmente, el resultado de dicho ensayo es determinado después de esto usando un dispositivo lector equipado para detectar el suceso que indica la presencia del analito. Un ejemplo de dicho sistema de ensayo se describe en el documento WO 03/033728, que trata de un método para detectar la presencia de un analito (tal como una β-lactama) en una muestra (tal como de productos alimenticios, p.ej. carne o leche, o de fluidos corporales, p.ej. sangre u orina) después de una incubación a 64ºC por determinación de los valores de colores de la muestra, asociados con el modelo de colores L*a*b, usando un escáner clásico acoplado a un ordenador. Esta última tecnología de lectura fue descrita también en el documento EP 953 149.

Una grave desventaja de estos métodos de la técnica anterior consiste en que solamente es posible realizar unas operaciones de lectura después de una incubación. Como resultado de esto, unos métodos de diagnóstico tales como unos ensayos microbiológicos para la detección de unos residuos antimicrobianos solamente dan un resultado negativo o positivo (es decir meramente indican si la concentración del analito está o no por encima o por debajo de un cierto valor de umbral) . En el caso de un resultado positivo obtenido con estos ensayos denominados de escrutinio, la muestra se ha de examinar adicionalmente para obtener una confirmación usando un segundo método de diagnóstico. En la mayor parte de los casos, dichos métodos de confirmación, p.ej. usando una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) o una espectrometría de masas, son extremadamente costosos y se necesita un largo período de tiempo antes de que se conozcan los resultados. Por lo tanto, sería ventajosa la lectura de los resultados del ensayo durante el ensayo de escrutinio propiamente dicho, puesto que esto proporcionaría el acceso a una información más detallada, que podría mejorar a unos parámetros tales como la duración del ensayo, el tipo del analito o la concentración del analito.

No obstante, la lectura de una información durante un ensayo y la simultánea incubación de dicho sistema de ensayo es conocida en unos métodos que se basan en la presencia de una fuente de luz situada en un extremo del sistema de ensayo y en la recogida de unas señales luminosas en el otro extremo del sistema de ensayo, un ejemplo de lo cual son los bien conocidos dispositivos lectores de ELISA. Este principio, desafortunadamente, tiene tres desventajas principales. En primer lugar, en unos sistemas de ensayo en los que la muestra es colocada sobre un substrato y la reacción requerida tiene lugar dentro del substrato, la naturaleza y la cantidad de la muestra perturbarán la medición cuando la luz u otro tipo de radiación se desplace a través tanto de la muestra como del substrato. En segundo lugar, el equipo usualmente empleado para dichas mediciones está dedicado y diseñado en la mayor parte de los casos para un personal entrenado y a ser usado en el entorno de un laboratorio. En tercer lugar, los principios de la técnica anterior están diseñados para medir solamente una longitud de onda particular. Por lo tanto, existe una necesidad de un equipo y de unos métodos que no padezcan de estas desventajas.

Sumario del invento Es un objeto del presente invento proporcionar una disposición de detección para detectar la presencia de un analito en una muestra, comprendiendo la disposición de detección: a) un procesador, b) una memoria, c) un presentador visual, d) un dispositivo de medición del color, y e) una... [Seguir leyendo]

1. Disposición de detección para detectar la presencia de un analito en una muestra, comprendiendo la disposición de detección: a) un procesador,

b) una memoria, c) un presentador visual, d) un dispositivo de medición del color, y e) una incubadora que comprende un dispositivo de calentamiento y una abertura para sostener una muestra, en donde el dispositivo de calentamiento está colocado dentro del dispositivo de medición del color,

en donde la memoria, el presentador visual y el dispositivo de medición del color están dispuesta/os para comunicarse con el procesador, el dispositivo de medición del color está dispuesto para generar unas señales luminosas, enviar dichas señales luminosas a dicha muestra, recibir unas señales luminosas de retorno procedentes de la muestra, convertir las señales luminosas de retorno en unas señales de colores y enviar las señales de colores al procesador, el procesador se hace funcionar mediante unas instrucciones almacenadas en la memoria y el procesador está configurado para realizar las etapas d del método de la reivindicación 4.

2. Disposición de detección de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la muestra está presente en un recipiente del que por lo menos el fondo es transparente.

3. Disposición de detección de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por que el dispositivo de medición del color es un escáner o una cámara digital.

4. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito en un fluido por análisis de unos datos de imágenes procedentes de un sistema de ensayo que genera un resultado de imagen en un medio de ensayo, comprendiendo el método las etapas de:

(a) incubar una muestra del fluido conjuntamente con el sistema de ensayo a una temperatura o un perfil de temperaturas que se ha ajustado previamente, 25 (b) obtener el resultado de imagen sobre el medio de ensayo,

(c) reproducir en imágenes el resultado de imagen con un dispositivo de adquisición de imágenes con el fin de generar unos datos de imágenes digitales que corresponden al resultado de imagen,

(d) usar unos medios de tratamiento de datos, que calculan para cada sistema de ensayo un valor de un parámetro

en donde xi es una señal de color i y wi es un factor de ponderación correspondiente e i es un índice que varía entre 1 y n, y n es un número entero igual al número de señales de colores, caracterizado por que la etapa a se lleva a cabo simultáneamente con las etapas b y c, y tan pronto como el requerido número de sistemas de ensayo (Nc) tiene un valor de Z (Zr) más bajo que un valor de Z previamente determinado (Zth) , se determina la presencia o ausencia de un analito en una muestra determinando en cada sistema de ensayo individual si el valor de Z del sistema de ensayo (Zs) es más alto, igual o más bajo que un valor de Z de umbral (Z de corte) o un valor de Z de una muestra de referencia con una cantidad conocida del analito que se ha detectar.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que la temperatura o el perfil de temperaturas que se ha ajustado previamente se mantiene por una incubadora que comprende un dispositivo de calentamiento y una abertura para sostener una muestra.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que se obtienen múltiples imágenes de un modo continuo o a intervalos regulares en el tiempo.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 6, que comprende además una 45 manipulación fotográfica.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 7, en donde se realizan las siguientes etapas: a) medir el valor de un parámetro compuesto Z para cada muestra y determinar el tiempo t1 en el que dicho valor de Z es igual a un valor Z1 y el tiempo t2 en el que dicho valor de Z es igual a un valor Z2;

b) calcular por medio de dicho procesador la diferencia Δt entre dicho tiempo t1 y dicho tiempo t2 de acuerdo con la fórmula Δt = t2 - t1.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 8, caracterizado por que el resultado del ensayo es proporcionado en menos de 120 minutos.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 9, caracterizado por que el medio de ensayo comprende un agente de gelificación, un indicador y un microorganismo.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que el medio de ensayo comprende además uno/a o más tampones, estabilizadores, sustancias que cambian la sensibilidad para ciertos analitos de un modo positivo o negativo y/o agentes aumentadores de la viscosidad.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 11, caracterizado por que la temperatura en la etapa a) fluctúa entre 63 y 66ºC.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 12, caracterizado por que el medio de ensayo está contenido en un tubo, una placa de microtitulación o una cubeta de Petri.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5A Figura 5B Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12