Cepa BG1 de Thermoanaerobacter mathranii.

Una cepa de de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BG1 (n.

º de registro DSMZ 18280) y sus mutantes, siendo capaces dicha cepa y dichos mutantes de esta de crecer en un medio que comprende un material de biomasa lignocelulósica hidrolizada que tiene un contenido en materia seca de al menos 10% en p/p.

Cepa BG1 de Thermoanaerobacter mathranii

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva bacteria termófila que pertenece al grupo de Thermoanaerobacter mathranii.

Antecedentes de la invención La industria de producción de productos de fermentación, tal como el etanol y ácido láctico, está enfrentándose al desafío de redirigir el procedimiento de producción desde la fermentación de materiales almidonados caros, pero de conversión relativamente fácil, hacia biomasas lignocelulósicas complejas, pero baratas, tales como madera y residuos de cultivos agrícolas, por ejemplo, paja. A diferencia del almidón, que contiene polímeros homogéneos y fácilmente hidrolizables, la biomasa lignocelulósica contiene celulosa (del 25-53%) , hemicelulosa (del 20-35%) , lignina polifenólica (del 10-25%) y otros componentes extraíbles. Generalmente, la primera etapa en la utilización de la biomasa lignocelulósica es una etapa de pretratamiento para fraccionar los componentes del material lignocelulósico y aumentar su superficie específica. El procedimiento de pretratamiento que se emplea más a menudo es la hidrólisis ácida, en la que el material lignocelulósico se somete a un ácido, tal como ácido sulfúrico, con lo cual los polímeros de azúcares de celulosa y hemicelulosa son parcial o completamente hidrolizados a sus constituyentes de monómeros de azúcar. Otro tipo de hidrólisis de la lignocelulosa es la explosión de vapor, un procedimiento que comprende calentar el material lignocelulósico mediante una inyección de vapor hasta una temperatura de 190-230 ºC. Un tercer procedimiento es la oxidación en húmedo, en la que el material se trata con oxígeno a 150-185 ºC. A los pretratamientos les puede seguir una hidrólisis enzimática para completar la liberación de los monómeros de azúcar. Esta etapa de pretratamiento da como resultado la hidrólisis de la celulosa en glucosa, mientras que la hemicelulosa se transforma en las pentosas xilosa y arabinosa y las hexosas glucosa, galactosa y manosa. Así, en contraste con el almidón, la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica da como resultado la liberación de azúcares de pentosa, además de azúcares de hexosa. Esto implica que los organimos fermentadores útiles deben ser capaces de convertir los azúcares de hexosa y pentosa en los productos de la fermentación deseados, tales como etanol.

Los microorganismos tradicionales utilizados, por ejemplo, para la fermentación del etanol, Sacchararomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis, no metabolizan las pentosas, tales como la xilosa y la arabinosa, y así es necesaria una modificación metabólica a gran escala para mejorar el rendimiento sobre sustratos lignocelulósicos. Las bacterias termófilas gram-positivas tienen ventajes exclusivas frente a las cepas de producción de etanol convencionales. Las principales ventajas son su amplia especificidad de sustrato y alta producción natural de etanol. Además, la fermentación del etanol a temperaturas elevadas (55-70 ºC) tiene muchas ventajas frente a la fermentación mesófila. Una ventaja de la fermentación termófila es la minimización del problema de la contaminación en cultivos continuos, puesto que solo unos pocos microorganismos son capaces de crecer a temperaturas tan altas en un hidrolizado de lignocelulosa no desintoxicado.

En la actualidad, dependiendo del procedimiento de pretratamiento, a menudo hay que añadir celulasas y hemicelulasas al hidrolizado lignocelulósico pretratado para liberar los monómeros de azúcar. Estas enzimas contribuyen significativamente a los costes de producción de los productos de la fermentación. Sin embargo, muchas cepas gram-positivas termófilas poseen una gama de enzimas pertinentes, y las adiciones suplementarias serán menos caras si se emplea una cepa gram-positiva termófila. La fermentación a alta temperatura también tiene la ventaja de una alta productividad y conversión del sustrato, y facilita la recuperación del producto.

Los hidrolizados de lignocelulosa contienen inhibidores, tales como furfural, fenoles y ácidos carboxílicos, que pueden inhibir potencialmente al organismo fermentador. Por tanto, el organismo también debe ser tolerante a estos inhibidores. El efecto inhibidor de los hidrolizados puede reducirse aplicando un procedimiento de desintoxicación antes de la fermentación. Sin embargo, la inclusión de esta etapa adicional del procedimiento aumenta significativamente el coste total del producto de la fermentación y preferiblemente debe evitarse. Por ejemplo, se ha calculado que la alcalinización del hidrolizado de sauce aumenta el coste de la producción de etanol empleando Escherichia coli al 22 % (Von Sivers et al., 1994) . Por tanto, se prefiere que el microorganismo sea capaz de producir productos de la fermentación a partir de hidrolizados de holocelulosa o hemicelulosa no desintoxicados para que puedan utilizarse en un procedimiento de fermentación con base lignocelulósica industrial, debido al alto coste del procedimiento de desintoxicación.

También resulta particularmente ventajoso si el microorganismo potencial es capaz de crecer sobre altas concentraciones de hidrolizados lignocelulósicos, es decir, hidrolizados lignocelulósicos con un alto contenido en materia seca. Esto resulta particularmente importante cuando el microorganismo se emplea para la producción de alcoholes, tal como la producción de etanol, puesto que los costes de la destilación aumentan con concentraciónes decrecientes de alcohol.

La patente de EEUU 6.555.350 describe una cepa de Thermoanaerobacter que es capaz de convertir pentosas en etanol. Sin embargo, esta cepa tiene una producción secundaria significativa de lactato y solo ha sido ensayada en hidrolizados lignocelulósicos que tienen una concentración de materia seca menor que 6% en p/p.

Larsen et al., 1997, describen una cepa A3 de Thermoanaerobacter mathranii que sólo puede crecer en hidrolizados de paja de trigo con una concentración de materia seca del 6% (60 g/l de peso seco de paja de trigo suplementada con xilosa) y se divulga que no es capaz de crecer sobre galactosa.

Carlier et al. (Anaerobe, 2006, 12:153-159) describe la nueva subespecie Alimentarius de Thermoanaerobacter mathranii que es capaz de crecer sobre galactosa.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo que es capaz de solucionar los obstáculos mencionados anteriormente, en particular para la producción de etanol.

Sumario de la invención Por consiguiente, la presente invención proporciona una cepa bacteriana de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BG1 (n.º de registro DSMZ 18280) y sus mutantes, siendo capaces dicha cepa y dichos mutantes de esta de crecer en un medio que comprende un material de biomasa lignocelulósica hidrolizada que tiene un contenido en materia seca de al menos 10% en p/p. Además, BG1 tiene una amplia especificidad de sustrato, y es capaz de utilizar pentosas, tales como xilosa y arabinosa, y hexosas. La cepa también tiene la ventaja de ser termófila y, así, es capaz de crecer a altas temperaturas, lo cual da como resultado altas productividades y velocidades de conversión del sustrato, bajo riesgo de contaminación, y se facilita la recuperación del producto.

La invención también proporciona un procedimiento para producir un producto de la fermentación mediante el cultivo de una cepa según la invención bajo condiciones adecuadas.

Descripción detallada de la invención Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere a una cepa de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BG1 y sus mutantes.

La cepa bacteriana aislada BG1se ha depositado según los términos del Tratado de Budapest el 17 de mayo de 2006 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania, con el n.º de registro DSMZ 18280.

Como resulta evidente a partir de lo siguiente, se han depositado las bacterias preferidas de la presente invención. Por tanto, otras bacterias de la presente invención pueden obtenerse mutando las bacterias depositadas y seleccionando los mutantes derivados que posean características mejoradas. Las características deseables incluyen una mayor gama de azúcares que puedan utilizarse, mayor velocidad de crecimiento, la capacidad de producir mayores cantidades de productos de la fermentación, tales como etanol, etc. Los procedimientos adecuados para mutar bacterias y seleccionar los mutantes deseados se describen en Functional analysis of Bacterial genes: A practical manual, editado por W. Schumann, S.D. Ehrlich & N. Ogasawara, 2001.

La cepa base BG1 es capaz de crecer y producir productos de la fermentación sobre hidrolizados lignocelulósicos... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BG1 (n.º de registro DSMZ 18280) y sus mutantes, siendo capaces dicha cepa y dichos mutantes de esta de crecer en un medio que comprende un material

de biomasa lignocelulósica hidrolizada que tiene un contenido en materia seca de al menos 10% en p/p.

2. Una cepa según la reivindicación 1, que es capaz de crecer a 70 ºC o por encima de 70 ºC.

3. Una cepa según la reivindicación 1, que es capaz de crecer sobre galactosa como única fuente de carbono.

4. Una cepa según la reivindicación 1, que es capaz de producir un producto de la fermentación seleccionado del grupo que consiste en un ácido, un alcohol, una cetona e hidrógeno.

5. Una cepa según la reivindicación 1, en la que uno o más genes han sido insertados, delecionados o sustancialmente inactivados.

6. Una cepa según la reivindicación 1, en la que un gen que codifica la lactato deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27) ha sido infrarregulado o sustancialmente inactivado.

7. Una cepa según la reivindicación 6, que es BG1L1 (n.º de registro DSMZ 18283) .

8. Una cepa según la reivindicación 1, en la que un gen que codifica la piruvato ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) ha sido infrarregulado o sustancialmente inactivado.

9. Una cepa según la reivindicación 8, que es BG1PF1 (n.º de registro DSMZ 18282) .

10. Una cepa según la reivindicación 1, en la que un gen que codifica una hidrogenasa o una subunidad de hidrogenasa ha sido infrarregulado o sustancialmente inactivado.

11. Una cepa según la reivindicación 10, que es BG1H1 (n.º de registro DSMZ 18281) .

12. Una cepa según la reivindicación 1, en la que un gen que codifica una acetato quinasa (EC 2.7.2.1) ha sido sustancialmente inactivado mediante la mutación, deleción o inserción de uno o más nucleótidos en dicho gen.

13. Una cepa según la reivindicación 1, en la que un gen que codifica una fosfato acetiltransferasa (EC 2.3.1.8) ha sido sustancialmente inactivado mediante la mutación, deleción o inserción de uno o más nucleótidos en dicho gen.

14. Una cepa según la reivindicación 1, en la que se han insertado uno o más genes.

15. Una cepa según la reivindicación 1, en la que se han insertado uno o más genes que codifican una polisacarasa.

16. Una cepa según la reivindicación 15, en la que la polisacarasa se selecciona del grupo que consiste en celulasas (EC 3.2.1.4) ; beta-glucanasas, que incluyen glucano 1, 3-beta-glucosidasas (exo-1, 3-beta-glucanasas, EC 3.2.1.58) , 1, 4-beta-celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) y endo-1, 3 (4) -beta-glucanasas (EC 3.2.1.6) ; xilanasas, que incluyen endo-1, 4-beta-xilanasas (EC 3.2.1.8) y xilano 1, 4-beta-xilosidasa (EC 3.2.1.37) ; pectinasas (EC 3.2.1.15) ; alfa-glucuronidasa, alfa-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) , acetilesterasa (EC 3.1.1. ) , acetilxilanesterasa (EC 3.1.1.72) , alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) , beta-amilasa (EC 3.2.1.2) , glucoamilasa (EC 3.2.1.3) , pululanasa (EC 3.2.1.41) , beta-glucanasa (EC 3.2.1.73) , hemicelulasa , arabinosidasa, mananasas, que incluyen manano endo

1, 4-beta-manosidasa (EC 3.2.1.78) y manano endo-1, 6-alfa-manosidasa (EC 3.2.1.101) , pectina hidrolasa, poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) , exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67) y pectato laasa (EC 4.2.2.10) .

17. Un procedimiento para producir un producto de la fermentación, que comprende cultivar una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1-16 bajo condiciones adecuadas.