Células modificadas mediante ingeniería genética desde el punto de vista metabólico para la producción de resveratrol o un derivado del mismo oligomérico o con unión glucosídica.

Un microorganismo que produce resveratrol, y dicho microorganismo tiene una ruta metabólica operativa queproduce ácido 4-cumárico y que produce resveratrol a partir suyo,

o un derivado oligomérico o con unión glicosídicadel mismo, en cuya ruta se produce ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalaninaamoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo, o a partir de tirosina por la acciónde una L-fenilalanina amoniaco liasa o de una tirosina amoniaco liasa expresadas en dicho microorganismo, seforma 4-cumaroil-CoA a partir de dicho ácido cumárico en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasaexpresada en dicho microorganismo,

y se produce resveratrol a partir de dicho 4-cumaroil-CoA en una reacción en la que el malonil-CoA endógeno es unsustrato mediante una resveratrol sintasa expresada en dicho microorganismo.

Células modificadas mediante ingeniería genética desde el punto de vista metabólico para la producción de resveratrol o un derivado del mismo oligomérico o con unión glucosídica Campo de la Invención Esta invención se refiere en general a la producción del polifenol resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo, tal como su R-glucósido piceido, mediante el uso de células microbianas. Además, se describen microorganismos naturales o recombinantes que producen resveratrol o dicho derivado para la producción de alimentos, piensos y bebidas.

Antecedentes de la Invención La producción de productos químicos a partir de microorganismos ha sido una aplicación importante de la biotecnología. En general, las etapas en el desarrollo de tal método de bio-producción pueden incluir 1) la selección de un microorganismo hospedador adecuado, 2) la eliminación de las rutas metabólicas que conducen a subproductos, 3) la desregulación de rutas deseadas tanto a nivel de la actividad enzimática como a nivel transcripcional, y 4) la sobreexpresión de las enzimas adecuadas en las rutas deseadas. En un aspecto preferido, la presente invención ha empleado combinaciones de las etapas anteriores para redirigir el flujo de carbono desde fenilalanina o tirosina por medio de enzimas de la ruta fenilpropanoide vegetal que suministra el precursor necesario para la biosíntesis deseada de resveratrol.

El resveratrol (o 3, 4, 5-trihidroxiestilbeno) es un fitofenol que pertenece al grupo de estilbeno fitoalexinas, que son metabolitos secundarios de masa molecular baja que constituyen el mecanismo de defensa activa en plantas en respuesta a infecciones u otros sucesos relacionados con agresiones. Las estilbeno fitoalexinas contienen el esqueleto de estilbeno (trans-1, 2-difeniletileno) como estructura básica común: también se puede complementar mediante la adición de otros grupos (Hart y Shrimpton, 1979, Hart, 1981) . Los estilbenos se han hallado en ciertos árboles (angiospermas, gimnospermas) , pero también en ciertas plantas herbáceas (en especies de las familias Myrtaceae, Vitaceae y Leguminosae) . Dichos compuestos son tóxicos para las plagas, en especial para hongos, bacterias e insectos. Solamente unas cuantas plantas tienen la capacidad de sintetizar estilbenos, o de producirlos en una cantidad que les proporciona una resistencia suficiente hacia las plagas.

La síntesis del esqueleto de estilbeno básico es llevada a cabo por las estilbeno sintasas. Hasta ahora, se han designado dos enzimas como estilbeno sintasas; la pinosilvina sintasa y la resveratrol sintasa. Hasta la fecha, la resveratrol sintasa de cacahuete (Arachis hypogaea) se ha caracterizado con más detalle, de forma que se conocen la mayoría de las propiedades (Schoppner y Kindl, 1984) . Los sustratos que usan las estilbeno sintasas son malonil-CoA, cinamoil-CoA o cumaroil-CoA. Estas sustancias se dan en todas las plantas, debido a que se usan en la biosíntesis de otros constituyentes vegetales importantes, así como flavonoides, pigmentos florales y lípidos.

El resveratrol (Fig. 1, forma trans) consiste en dos anillos de fenol conectados a poca distancia, y por lo tanto pertenece a los polifenoles. Aunque está presente en otras plantas, tales como eucalipto, pícea, y lirio, y en otros alimentos tales como moras y cacahuetes, las fuentes naturales más abundantes de resveratrol son las uvas de Vitis vinifera, -labrusca, y -muscadine (rotundifolia) , que se usan para producir vinos. El compuesto se da en las vides, raíces, semillas, y tallos, pero su concentración más alta está en la piel (Celotti et al., 1996) , que contiene 50-100 μg/g. (Jang et al. 1997) . Durante la vinificación del vino tinto, las pieles de las uvas se incluyen en el mosto, en contraste con la vinificación del vino blanco, y por lo tanto el resveratrol se halla en pequeñas cantidades solamente en el vino tinto. El resveratrol se ha reconocido, además de por sus propiedades antifúngicas, por sus actividades cardioprotectoras y quimiopreventivas del cáncer; actúa como un fitoestrógeno, un inhibidor de la agregación plaquetaria (Kopp et al, 1998; Gehm et al 1997; Lobo et al 1995) , y un antioxidante (Jang et al., 1997; Huang 1997) . Estas propiedades explican la denominada paradoja francesa, es decir, los franceses que beben vino tienen una incidencia baja de cardiopatía coronaria a pesar de una dieta elevada en grasas y poco ejercicio. Recientemente se ha demostrado que el resveratrol puede activar también el gen SIR2 en levadura, y el gen humano análogo SIRT1, que desempeñan un papel clave en prolongar la vida. Desde entonces se ha centrado la atención en gran medida en las propiedades de prolongación de la vida de resveratrol (Hall, 2003, Couzin, 2004) .

Las asociaciones sanitarias americanas, tales como la Life Extension Foundation, están promocionando los amplios efectos beneficiosos de este fármaco, y por lo tanto están impulsando las condiciones ideales para una comercialización favorable. Los procedimientos de producción actuales dependen en gran medida de la extracción de resveratrol, de la piel de las uvas o de plantas del género Polygonum. Este es un procedimiento muy laborioso y genera un rendimiento bajo que, por tanto, da lugar a un estímulo para el desarrollo de procesos de producción nuevos, más eficaces y de alto rendimiento.

En las plantas, la ruta fenilpropanoide es responsable de la síntesis de una amplia diversidad de compuestos metabólicos secundarios, que incluyen ligninas, salicilatos, cumarinas, amidas hidroxicinámicas, pigmentos, flavonoides y fitoalexinas. De hecho, la formación de resveratrol en las plantas se desarrolla por medio de la ruta fenilpropanoide. El aminoácido L-fenilalanina se convierte en ácido trans-cinámico por medio de la desaminación nooxidativa mediante la L-fenilalanina amoniaco liasa (PAL) (Fig. 2) . A continuación, el ácido trans-cinámico se hidroxila en la posición para hasta ácido 4-cumárico (ácido 4-hidroxicinámico) mediante la cinamato-4-hidroxilasa (C4H) , una enzima citocromo P450 monooxigenasa, junto con la NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) . El ácido 4-cumárico se activa posteriormente hasta 4-cumaroil-CoA mediante la acción de la 4-cumarato-CoA ligasa (4CL) . Finalmente, la resveratrol sintasa (VST) cataliza la condensación de una unidad de fenilpropano de 4-cumaroil-CoA con malonil CoA, lo que da como resultado la formación de resveratrol.

Recientemente, se describió una levadura que podía producir resveratrol a partir de ácido 4-cumárico que se halla en pequeñas cantidades en el mosto de la uva (Becker et al. 2003) . La producción de 4-cumaroil-CoA, y el resveratrol concomitante, en las cepas de laboratorio de S. cerevisiae, se consiguió mediante la co-expresión de un gen heterólogo de coenzima-A ligasa, de álamo híbrido, junto con el gen de resveratrol sintasa de vid (vstl) . El otro sustrato para la resveratrol sintasa, malonil-CoA, ya se produce de forma endógena en levadura y está implicado en la biosíntesis de novo de ácidos grasos. El estudio demostró que las células de S. cerevisiae podrían producir cantidades diminutas de resveratrol, en forma libre o en la forma con unión de glucósido, cuando se cultivan en un medio sintético que se complementó con ácido 4-cumárico.

Sin embargo, dicha levadura no sería adecuada para una aplicación comercial, ya que tiene un bajo rendimiento de resveratrol, y requiere la adición de ácido 4-cumárico, que está presente solamente en unos pocos medios industriales. Para facilitar y ampliar la aplicación de resveratrol como producto farmacéutico y nutracéutico, es por tanto sumamente deseable obtener una levadura que pueda producir resveratrol directamente a partir de glucosa, sin la adición de ácido 4-cumárico.

Un estudio reciente (Ro y Douglas, 2004) describe la reconstitución del punto de entrada de la ruta fenilpropanoide en S. cerevisiae mediante la introducción de PAL, C4H y CPR de álamo. El propósito fue determinar si los complejos multienzimáticos (MECs) que contienen PAL y C4H son funcionalmente importantes en este punto de entrada en el metabolismo fenilpropanoide. Alimentando a la levadura recombinante con [3H]-fenilalanina, se descubrió que la mayoría de la [3H]-fenilalanina metabolizada se incorporó en el ácido 4-[3H]-cumárico, y que el metabolismo de la fenilalanina se redujo en gran medida inhibiendo la actividad de C4H. Además, las levaduras que expresaron solamente PAL metabolizaron muy poca fenilalanina hasta ácido cinámico. Cuando se alimenta [3H]-fenilalanina y ácido [14C]-trans-cinámico de manera simultánea a las levaduras que expresaron los tres, no se descubrió ninguna prueba de la canalización del ácido [3H]-trans-cinámico sintetizado de forma... [Seguir leyendo]

1. Un microorganismo que produce resveratrol, y dicho microorganismo tiene una ruta metabólica operativa que produce ácido 4-cumárico y que produce resveratrol a partir suyo, o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo, en cuya ruta se produce ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo, o a partir de tirosina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa o de una tirosina amoniaco liasa expresadas en dicho microorganismo, se forma 4-cumaroil-CoA a partir de dicho ácido cumárico en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasa expresada en dicho microorganismo,

y se produce resveratrol a partir de dicho 4-cumaroil-CoA en una reacción en la que el malonil-CoA endógeno es un sustrato mediante una resveratrol sintasa expresada en dicho microorganismo.

2. Un microorganismo según la reivindicación 1, en el que dicha resveratrol sintasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

3. Un microorganismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha cinamato 4-hidroxilasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

4. Un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se expresa una tirosina amoniaco liasa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

5. Un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se expresa una L-fenilalanina amoniaco liasa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

6. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) nativa se ha sobreexpresado en dicho microorganismo, o en el que una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) se ha introducido de manera recombinante en dicho microorganismo.

7. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una tirosina amoniaco liasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

8. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una L-fenilalanina amoniaco liasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

9. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una cinamato 4-hidroxilasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

10. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una 4-cumarato-CoA ligasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

11. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una resveratrol sintasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

12. Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, que es un hongo o bacteria.

13. Un microorganismo según la reivindicación 12, que es una levadura.

14. Un microorganismo según la reivindicación 13, que es una Saccharomyces cerevisiae.

15. Un microorganismo según la reivindicación 1, que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica L-fenilalanina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica cinamato-4-hidroxilasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato CoA-ligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

16. Un microorganismo según la reivindicación 1, que carece de actividad cinamato-4-hidroxilasa, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica tirosina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión o L-fenilalanina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de

expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato CoAligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

17. Un método para la producción de resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo que

comprende poner en contacto un microorganismo según cualquier reivindicación precedente con un sustrato de carbono.

18. Un método según la reivindicación 15, llevado a cabo en ausencia sustancial de una fuente externa de ácido 4cumárico.

19. Un método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicho sustrato de carbono se selecciona 10 del grupo de sustratos de carbono fermentables que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

20. Un método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicho sustrato de carbono se selecciona del grupo de sustratos de carbono no fermentables que consiste en etanol, acetato, glicerol, lactato y aminoácidos.

21. Un método según la reivindicación 18, en el que dicho sustrato de carbono no fermentable se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina y tirosina.

22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que incluye además el uso de dicho resveratrol producido o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo como un producto nutracéutico en un producto lácteo o una bebida.

ácido cumárico ácido cinámico patrón de resveratrol forma cis y trans 60 nanogramos en total

cepa de S. cerevisiae: FSSC-control (vectores vacíos)

cepa de S. cerevisiae: FSSC-PALC4H4CLVST (ruta de PAL)

cepa de S. cerevisiae: FSSC-TALC4CLVST (ruta de TAL)

espectro UV de transresveratrol puro 60 nanogramos en total

espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de S. cerevisiae FSSC-PALC4H4CLVST (ruta de PAL)

espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de S. cerevisiae FSSC-TAL4CLVST (ruta de TAL)

ácido cumárico ácido cumárico cepa de E. coli: FSEC-control (vectores vacíos) + 20 mg/l de ácido cumárico

cepa de E. coli: FSEC-TAL4CLVST (ruta de TAL) + 20 mg/l de ácido cumárico

espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de E. coli FSEC-TAL4CLVST (ruta de TAL)