Casetes de expresión para la expresión específica de semillas en plantas.

Un método para regular la expresión específica de semillas en plantas,

comprendiendo dicho método (a)proporcionar un casete de expresión que comprende un promotor enlazado operablemente a un ácido nucleico quees heterólogo con relación a dicho promotor, en el que dicho promotor tiene la secuencia nucleotídica de SEC IDNO: 1 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, y (b)transformar una planta con dicho casete de expresión.

Casetes de expresión para la expresión específica de semillas en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para la expresión de un gen de interés específicamente en semillas de plantas, incluso más específicamente en plantas oleaginosas. La invención proporciona además el uso de un casete de expresión para regular la expresión específica de semillas en plantas.

Introducción a la invención Las plantas usan carbono fijado fotosintéticamente para respaldar el crecimiento y para acumular productos de reserva, tales como almidón o lípidos. El aceite de almacenamiento (triacilglicerol) es un producto vegetal importante con gran importancia económica en la nutrición humana y como una materia prima renovable para diversos productos industriales y biocombustibles. La producción a nivel mundial de aceite vegetal es aproximadamente 100 millones de toneladas métricas en total por año, que consiste principalmente en haba de soja, aceite de palma, aceite de colza y aceite de girasol. La producción de colza está aumentando a nivel mundial. La cosecha se usa principalmente para pienso y alimento, pero, cada vez más, se está usando en la producción de biocombustibles. Como resultado de la gran importancia económica de los aceites vegetales y su uso ampliado como materia prima renovable, hay un considerable interés en la manipulación metabólica del contenido incrementado y/o modificado de oleaginosas. En semillas de colza (Brassica napus L.) , en desarrollo, la sacarosa se descarga del floema y se metaboliza a intermedios glucolíticos, tales como fosfatos de hexosas, fosfoenolpiruvato y piruvato, que son importados subsiguientemente en el plastidio y usados para la síntesis de ácidos grasos. Los ácidos grasos libres son activados a ésteres de coenzima A (CoA) , son exportados desde el plastidio y se usan para la acilación por etapas de la cadena principal de glicerol para sintetizar triacilglicerol en el retículo endoplásmico. En las dos primeras etapas del ensamblaje del triacilglicerol (TAG) , glicerol-3-fosfato (Gly3P) se acila mediante Gly3P aciltransferasa (GPAT) hasta ácido lisofosfatídico, que entonces se acila posteriormente mediante ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAT) hasta ácido fosfatídico. A esto le sigue la desfosforilación del ácido fosfatídico por ácido fosfatídico fosfohidrolasa, para liberar diacilglicerol (DAG) , y la acilación final de diacilglicerol por DAG aciltransferasa (DAGAT) . El almacenamiento final de triacilglicerol se produce en cuerpos grasos derivados del retículo endoplásmico.

La modificación de plantas que producen aceite, para alterar y/o mejorar las características fenotípicas (tales como productividad o calidad) , requiere la sobreexpresión o disminución de genes endógenos, o la expresión de genes heterólogos en tejidos vegetales. Tal modificación genética se basa en la disponibilidad de un medio para llevar a cabo y controlar la expresión génica según se requiera. De hecho, la modificación genética se basa en la disponibilidad y uso de promotores adecuados, que son eficaces en plantas y que regulan la expresión génica para dar el efecto o efectos deseados en la planta transgénica. Para numerosas aplicaciones en biotecnología vegetal, es ventajoso un perfil de expresión específico de tejidos, puesto que efectos beneficiosos de la expresión en un tejido pueden tener desventajas en otros. Los promotores preferentes de semillas o específicos de semillas son útiles para expresar o disminuir genes, así como para producir grandes cantidades de proteína, y para producir aceites o proteínas de interés. Es ventajoso tener la elección de una variedad de diferentes promotores, de manera que se pueda seleccionar el promotor más adecuado para un gen particular, constructo, célula, tejido, planta o entorno. Además, el creciente interés en plantas cotransformantes con múltiples casetes de transcripción, y los problemas potenciales asociados con el uso de secuencias reguladoras comunes para estos fines, requiere una variedad de secuencias promotoras. Por lo tanto, existe una gran necesidad en la técnica de identificar nuevas secuencias que se puedan usar para la expresión de transgenes seleccionados en plantas económicamente importantes tales como plantas productoras de aceite. De este modo, es un objetivo de la presente invención proporcionar casetes de expresión nuevos y alternativos para la expresión específica de semillas de transgenes en plantas. Este objetivo se resuelve mediante la presente invención como se explica aquí adicionalmente.

Las citocromo P450 monooxigenasas, que catalizan etapas de oxigenación específicas del sustrato, regioespecíficas y estereoespecíficas en el metabolismo vegetal, han evolucionado hasta una enorme superfamilia de enzimas. Recientemente, las iniciativas de secuenciación del genoma vegetal revelaron más de 280 genes de longitud completa en Arabidopsis thaliana, 356 en arroz y 312 en Populus trichocarpa. Sin embargo, menos del 20% de las secuencias codificantes de las citocromo P450 monooxigenasas en el genoma de A. thaliana se han asociado con una función bioquímica específica.

Sumario de la invención Durante nuestra investigación, nos interesamos en la función de las enzimas del citocromo P450 “huérfanas”. Una familia de enzimas particular que se caracterizó fue la familia CYP704 de citocromo P450 monooxigenasas, que consiste en los dos miembros CYP704A1 y CYP704A2. De forma notable, se demostró que un casete de expresión que comprende una fusión quimérica de un promotor de CYP704A1 con ácido nucleico se expresó específicamente durante las etapas tardías del desarrollo de las semillas. La invención descrita aquí en las diferentes realizaciones, ejemplos, figuras y reivindicaciones proporciona el uso de promotores específicos de semillas y regiones promotoras comprendidas en casetes de expresión para dirigir la expresión de genes heterólogos en semillas. En una realización de la invención, se proporciona un método para regular la expresión específica de semillas en plantas, que comprende (a) proporcionar un casete de expresión para regular la expresión específica de semillas en plantas, que comprende un promotor enlazado a un ácido nucleico que es heterólogo con relación a dicho promotor, y en el que dicho promotor tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad de secuencias con SEC ID NO: 1, y (b) transformar una planta con dicho casete de expresión. SEC ID NO: 1 representa la secuencia nucleotídica del promotor del gen del citocromo P450 704A1 procedente de A. thaliana. Dicho casete de expresión puede dirigir la expresión de una proteína, un polipéptido, un péptido, un ARN antisentido, un ARN sentido o un ARN bicatenario.

En una realización particular, dicho método se aplica a una planta usada para la producción de aceite. Las plantas particulares son cánola, maíz, mostaza, haba de ricino, sésamo, algodón, linaza, haba de soja, Arabidopsis, Phaseolus, cacahuete, alfalfa, trigo, arroz, avena, sorgo, colza, centeno, caña de azúcar, alazor, palmas de aceite, lino, girasol, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica juncea, Crambe abyssinica.

En una realización adicional, el método según la invención comprende además las etapas de (c) hacer crecer una planta que contiene dicho casete de expresión, en el que dicha planta produce semilla, y dicho ácido nucleico se transcribe en dicha semilla, y (d) aislar dicha semilla de dicha planta transformada.

En todavía otra realización, la invención proporciona el uso del casete de expresión como se describe para regular la expresión específica de semillas de un gen heterólogo en plantas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Análisis de RT-PCR cuantitativa de la expresión del gen CYP704A1 en diferentes órganos de Arabidopsis thaliana. Las cantidades de transcritos de CYP704A1 (2-!!Ct) se normalizan con respecto a la referencia endógena ACTIN2. Los datos representan la media de 3 muestras con desviación estándar. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. Representación en forma de gráfica de barras verticales de la evaluación mediante RT-PCR cuantitativa de la expresión de los transcritos de CYP704A1 en diferentes órganos de Arabidopsis thaliana. Los (datos 2-!!Ct) se dedujeron mediante el método Ct.

Figura 2 (para referencia solamente) : RT-PCR cuantitativa de la expresión del gen CYP704A2 en diferentes órganos de Arabidopsis thaliana. Las cantidades de transcritos de CYP704A2 (2-!!Ct) se normalizan con respecto a la referencia endógena ACTIN2. Los datos representan la media de 3 muestras con desviación estándar. El experimento... [Seguir leyendo]

1. Un método para regular la expresión específica de semillas en plantas, comprendiendo dicho método (a) proporcionar un casete de expresión que comprende un promotor enlazado operablemente a un ácido nucleico que es heterólogo con relación a dicho promotor, en el que dicho promotor tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID

NO: 1 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, y (b) transformar una planta con dicho casete de expresión.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la expresión del ácido nucleico da como resultado la expresión de una proteína, o expresión de un ARN antisentido, ARN sentido o ARN bicatenario.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha planta es una planta usada para la producción de aceite.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en cánola, maíz, mostaza, haba de ricino, sésamo, algodón, linaza, haba de soja, Arabidopsis, Phaseolus, cacahuete, alfalfa, trigo, arroz, avena, sorgo, colza, centeno, caña de azúcar, alazor, palmas de aceite, cáñamo, girasol, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica juncea, Crambe abyssinica.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además las etapas de (c) hacer

crecer una planta que contiene dicho casete de expresión, en el que dicha planta produce semillas, y dicho ácido nucleico es transcrito en dichas semillas, y (d) aislar dichas semillas de dicha planta transformada.

6. Uso del casete de expresión como se describe en la reivindicación 1 para regular la expresión específica de semillas de un gen heterólogo en plantas.