Anticuerpos monoclonales para progastrina.

Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a progastrina,

en el que:

el anticuerpo no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly) ogastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly); y

el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo en el tramo N terminal deprogastrina, en el que el epítopo aparece dentro de la secuencia de aminoácidos SWKPRSQQP (SEC ID Nº: 6)o SQQPDAPLG (SEC ID Nº: 7).

Anticuerpos monoclonales para progastrina

Campo de la invención La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra regiones específicas del precursor de la hormona gastrina, progastrina, hallado in vivo en un animal, en particular un ser humano. La invención se refiere además a la aplicación de estos anticuerpos monoclonales (mAb) para detección, diagnóstico y supervisión de enfermedades y

afecciones promovidas por gastrina, y a procedimientos de uso de los mAb de la invención para la prevención y tratamiento de enfermedades y afecciones promovidas por gastrina. La invención también se refiere a moléculas sustitutas y su uso como patrones de referencia en inmunoensayos, particularmente como se aplican a hormonas peptídicas.

Antecedentes de la invención La preprogastrina humana, un péptido de 101 aminoácidos, es el producto de traducción primario del gen de gastrina y tiene la siguiente estructura:

MQRLCVYVLIFALALAAFSE ASWKPRSQQP DAPLGTGANR DLELPWLEQQ GPASHHRRQL GPQGPPHLVA DPSKKQGPWL EEEEEAYGWM DFGRRSAEDE N (SEC ID Nº: 1) .

La progastrina se forma por escisión de los primeros 21 aminoácidos (que constituyen el péptido señal) de preprogastrina. La cadena de 80 aminoácidos de longitud de progastrina se procesa adicionalmente por escisión y

enzimas de modificación a varias formas de hormona gastrina biológicamente activas, incluyendo gastrina-17 (G17) , gastrina-34 (G34) , gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly) y gastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly) .

La G17 madura está modificada en los restos tanto amino como carboxilo terminales: la glutamina N terminal ciclada para formar ácido piroglutámico (pGlu) y el grupo carboxilo libre del resto de fenilalanina C terminal está amidado por

la enzima, monooxigenasa amidante de peptidil α (PAM) para formar un Phe-NH2 C terminal. La G34 madura está amidada de forma idéntica en su extremo C terminal para formar un Phe-NH2 C terminal. (Véase Dockray et al., Ann. Rev. Physiol. (2001) 63: 119-139) .

La G17 madura, la forma predominante de la gastrina “pequeña” en seres humanos, tiene la secuencia de aminoácidos: pEGP-WLEEEEEAYGWMDF-NH2 (SEC ID Nº: 2) . G17-Gly es una forma procesada de forma incompleta de gastrina hallada como un componente menor de gastrina “pequeña” en sujetos humanos sanos y tiene la secuencia de aminoácidos: pEGPWLEEEEEAYGWMDFG (SEC ID Nº: 3) .

La gastrina 34, la forma predominante de gastrina “grande” en seres humanos, tiene la secuencia de aminoácidos:

pELGPQGPPHL VADPSKKQGPWLEEEEEA YGWMDF-NH2 (SEC ID Nº: 4) . La gastrina 34 extendida con glicina (G34-Gly) tiene un resto de glicina C terminal y tiene la secuencia de aminoácidos: pELGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG (SEC ID Nº: 5) .

La gastrina se secreta por las células G antrales pilóricas del estómago en respuesta a péptido liberador de gastrina 45 (GRP) , y se suprime por ácido gástrico y la acción paracrina de varias hormonas peptídicas, más notablemente, somatostatina. Se ha reconocido durante mucho tiempo que los péptidos de gastrina actúan para estimular la secreción de ácido en el estómago de individuos sanos, sin embargo, se ha mostrado solo recientemente que estos péptidos también controlan la proliferación, diferenciación y maduración de diferentes tipos celulares en el sistema gastrointestinal (GI) .

La progastrina normalmente se procesa completamente a formas de hormona gastrina. Cuando se produce en exceso, la progastrina se procesa al menos parcialmente en una o más formas de hormona gastrina que actúan en el sistema gastrointestinal y pueden potenciar la formación de tumores promovidos por gastrina. En algunos casos la progastrina circula en sangre y puede detectarse en la orina de pacientes que padecen enfermedades o afecciones 55 promovidas por progastrina.

Además de su actividad local en el sistema GI, G17 y, en menor grado, G17-Gly se liberan al torrente sanguíneo y se ha descubierto que aumentan en el suero de pacientes aquejados de trastornos y enfermedades gastrointestinales, tales como cáncer gástrico, cáncer colorrectal y cáncer pancrático. También se ha descubierto 60 recientemente que estas especies de gastrina están asociadas con otras enfermedades no asociadas con el tracto gastrointestinal, incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC) y tumores metastatizados de hígado. Véase por ejemplo “Gastrin and Colon Cancer: a unifying hypothesis” S. N. Joshi et al., Digestive Diseases (1996)

14: 334-344; y “Gastrin and Colorectal Cancer” Smith, A. M. and Watson, S.A. (2000) Alimentar y Pharmacology and

Therapeutics 14 (10) : 1231-1247. 65

Los anticuerpos son reactivos clave en numerosas técnicas de ensayo usadas en los campos médico, veterinario y otros de inmunodetección. Tales ensayos incluyen muchas técnicas de inmunoensayo usadas habitualmente, tales como por ejemplo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) , radioinmunoensayos (RIA) , ensayos de immunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) .

Jonsson y Dockray, Regulator y Peptides, 8 (1984) , pp. 283-290, desvelan anticuerpos policlonales contra fragmentos N terminales de progastrina porcina.

Se ha mostrado que los anticuerpos policlonales antigastrina son eficaces en la inhibición de la actividad de gastrina (“Inhibition of gastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide of gastrin” Jaffe et al., Surger y (1969) 65 (4) : 633-639) ; y se han aplicado anticuerpos policlonales antigastrina no humanos a terapia en un paciente que padece síndrome de Zollinger-Ellison, una afección patológica en la que se produce gastrina en exceso sin estimulación por alimentación. Véase Hughes et al., “Therapy with Gastrin Antibody in the Zollinger-Ellison Syndrome” Hughes et al., Digestive Diseases (1976) 21 (3) : 201-204. Sin embargo, estos anticuerpos antigastrina de conejo tuvieron, “en el mejor de los casos un efecto a corto plazo en este paciente” (Hughes en p. 204) . Las patentes de Estados Unidos 5.886.128 y 5.785.970 describen métodos de tratamiento de úlceras o tumores cuyo crecimiento depende de o está estimulado por hormonas gastrina inmunizando con conjugados peptídicos de hormona gastrina.

Hasta ahora, no han estado disponibles mAb capaces de detectar de forma sensible y distinguir de forma precisa progastrina de las formas procesadas de la hormona gastrina. Además, hasta la presente invención, no fue posible medir de forma precisa la cantidad de progastrina en una muestra, tal como por ejemplo una muestra de fluido biológico. Los mAb de la invención pueden usarse en ensayos para pruebas clínicas para definir de forma precisa la biología de la progastrina en estados normales y patológicos. La invención también proporciona composiciones de mAb para uso farmacéutico y métodos para la prevención y tratamiento de enfermedades y afecciones promovidas por progastrina.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal de unión a progastrina que se une selectivamente a progastrina, en el que la molécula no se une a gastrina-17 (G17) , gastrina-34 (G34) , gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly) como se define en las reivindicaciones. La molécula de unión a progastrina es una molécula de anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, una región de unión a anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla.

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 1-9 de progastrina, es decir SWKPRSQQP (SEC ID Nº: 6) . También se proporcionan hibridomas que producen los mAb que se unen selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 1-9 de progastrina, es decir SWKPRSQQP (SEC ID Nº: 6) .

La presente invención proporciona un mAb que se une selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 6-14, es decir SQQPDAPLG (SEC ID Nº: 7) . También se proporcionan hibridomas que producen mAb que se unen selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 6-14, SQQPDAPLG (SEC ID Nº: 7) .

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un mAb que se une selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 72-80 de progastrina, GRRSAEDEN (SEC ID Nº: 8) . También se proporcionan hibridomas que producen mAb que se unen selectivamente a progastrina en un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos 72-80, GRRSAEDEN (SEC ID Nº: 8) .

De acuerdo con... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a progastrina, en el que:

el anticuerpo no se une a gastrina-17 (G17) , gastrina-34 (G34) , gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly) ; y el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo en el tramo N terminal de progastrina, en el que el epítopo aparece dentro de la secuencia de aminoácidos SWKPRSQQP (SEC ID Nº: 6)

o SQQPDAPLG (SEC ID Nº: 7) . 10

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que es el anticuerpo monoclonal producido por el hibridom.

49. 1 (ATCC Nº de Referencia PTA-6189) o por el hibridom.

49. 1 (ATCC Nº de Referencia PTA-6190) .

3. Una forma de cadena sencilla de un anticuerpo de la reivindicación 1 que se une al extremo N terminal de 15 progastrina.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 que es un anticuerpo de mamífero.

5. Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que se une al epítopo unido con el anticuerpo

monoclonal producido por el hibridom.

49. 1 (ATCC Nº de Referencia PTA-6189) o hibridom.

49. 1 (ATCC Nº de Referencia PTA-6190) .

6. Un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-5 que es un anticuerpo murino, quimérico humano/ratón, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. 25

7. Una combinación, que comprende dos o más anticuerpos monoclonales seleccionados de entre los anticuerpos monoclonales de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un hibridoma seleccionado de entre el hibridom.

49. 1 (ATCC Nº de Referencia PTA-6189) e hibridom.

49. 1 30 (ATCC Nº de Referencia PTA-6190) .

9. Una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. Uso de un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la 35 fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o afección promovida por gastrina.

11. Un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección promovida por gastrina.

12. Un inmunoensayo de progastrina, que comprende:

a) poner en contacto una muestra para ensayar con respecto a progastrina con un anticuerpo monoclonal en condiciones adecuadas para unión de anticuerpo y permitir que cualquier progastrina presente forme un complejo de monoclonal-progastrina, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona de entre un anticuerpo 45 monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y b) detectar la presencia o ausencia del complejo de anticuerpo monoclonal-progastrina por un método de inmunodetección.

13. El inmunoensayo de progastrina de la reivindicación 12, en el que el método de inmunodetección es un ensayo 50 de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , un ensayo de immunohistoquímica (IHC) , un ensayo de inmunofluorescencia (IF) , un ensayo de aglutinación, un ensayo de transferencia de western, un ensayo de transferencia puntual, un ensayo de transferencia por ranuras, o un método de detección de resistencia de plasmón superficial.

14. Un método para diagnosticar una enfermedad o afección promovida por gastrina en un paciente, que comprende:

(a) realizar un inmunoensayo de la reivindicación 12 o reivindicación 13 para determinar el nivel de progastrina en una muestra de fluido biológico del paciente; y

(b) comparar el nivel de progastrina en la muestra con el nivel de progastrina en una muestra de fluido biológico de

uno o más individuos de control o con un patrón de referencia y, si son diferentes, diagnosticar la enfermedad o afección.