Anticuerpos monoclonales dirigidos a tumores para FZD10 y usos de los mismos.

Un anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento del mismo que se une a la proteína FZD10 y en el quelas regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 92-13(FERM BP-10628).

Anticuerpos monoclonales dirigidos a tumores para FZD10 y usos de los mismos Campo de la invención La presente invención se relaciona con un anticuerpo o un fragmento del mismo que es capaz de unirse a la proteína de homólogo Frizzled 10 (FZD10) , tal como un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado. También, la presente invención se relaciona con un método para tratar y/o evitar la enfermedad asociada con FZD10; un método para el diagnóstico o pronóstico de la enfermedad asociada con FZD10; y un método para formación de imágenes in vivo de FZD10 en un sujeto.

Antecedentes de la invención Se ha probado que los anticuerpos monoclonales contra moléculas específicas de cáncer son útiles en el tratamiento de cáncer (Harris, M (2004) . Lancet Oncol, 5, 292-302.) . Además de los ejemplos exitosos de aplicación clínica de los anticuerpos quiméricos o humanizados tal como trastuzumab (Baselga, J. (2004) . Oncology, 61, Suupl 2 14-21.) , rituximab (Maloney, D.G, et al. (1997) . Blood, 90, 2188-95.) y bevacizumab (Ferrara, N., et al. (2004) . Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400.) para cáncer de mama, linfoma maligno y cáncer de colon, una serie de anticuerpos monoclonales contra otros objetivos moleculares están en desarrollo y se evalúan sus actividades anti-neoplásicas. Se espera que estos anticuerpos monoclonales proporcionen una esperanza a pacientes que tienen tumores que no tienen tratamiento efectivo. Uno de los asunto más importantes para estos anticuerpos monoclonales es el logro de efectos terapéuticos selectivos a células neoplásicas sin toxicidad severa debido a su reacción específica a células que expresan moléculas objetivo (Crist, W.M., et al. (2001) . J Clin Oncol, 19, 3091-102.; Wunder, J.S., et al. (1998) . J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-33.; Ferguson, W.S. y Goorin, A.M. (2001) . Cancer Invest, 19, 292-315.) .

Entre los sarcomas de tejido blando, osteosarcoma, sarcoma de Ewing y rabdomiosarcoma son sensibles a quimioterapia y estas enfermedades se pueden manejar bien por quimioterapia. De otra parte, sarcomas de células fusiformes son resistentes a quimio- y radioterapia y pacientes que usualmente exhiben pobre pronóstico. Para el sarcoma sinovial (SS) , el tratamiento quirúrgico es efectivo para pacientes en una etapa temprana, pero no está disponible el fármaco terapéutico efectivo en aquellos en una etapa avanzada. Por lo tanto, se espera el desarrollo de modalidades terapéuticas novedosas para mejorar el pronóstico del paciente.

El análisis de expresión de en amplio de genoma en tumores proporciona la información útil para identificar los nuevos objetivos moleculares para el desarrollo de fármacos antineoplásicos novedosos y marcadores de tumor. En estudio previo, los presentes inventores han analizado el perfil de expresión de gen de diversos sarcomas de tejido humano utilizando microdisposición de cADN amplio de genoma que consiste de 23, 040 genes y demuestra que el homólogo Frizzled 10 (FZD10) (Nos. de Acceso GenBank AB027464 (SEQ ID NO:1) y BAA84093 (SEQ ID NO:2) ) se regula por aumento específicamente y frecuentemente en SS (Nagayama, S., et al. (2002) Cancer Res, 62, 585966.; y WO2004/020668) . El producto de gen FZD10 es un miembro de la familia Frizzled y un receptor de señal WNT putativo (Koike, J., et al. (1999) . Biochem Biophys Res Commun, 262, 39-43.) . El análisis adicional muestra que el FZD10 se expresa específicamente en SS, y no en o nivel fuertemente detectable en otros órganos normales excepto la placenta, lo que sugiere que los agentes terapéuticos dirigen esta molécula no provocarían o poca reacción adversa (Nagayama, S., et al. (2002) . Cancer Res, 62, 5859-66.) . Los experimentos ARNi implican que el FZD 10 está involucrado significativamente en el crecimiento de tumor de SS (WO2006/013733) . Adicionalmente, los presentes inventores generan el anticuerpo policlonal de conejo contra el dominio extracelular de FZD10 (FZD10-ECD) , y encuentra que este anticuerpo tiene actividad antineoplásica en modelo de xenoinjerto de ratón de SS (Nagayama, S., et al. (2005) . Oncogene, 24, 6201-12.; y WO2005/004912) . En conjunto, se puede esperar que el anticuerpo terapia contra FZD10 mejore el resultado clínico de SS.

Resumen de la invención Adelante se reporta que la generación de anticuerpos monoclonales de murino contra FZD10 por medio de método de inmunización de célula para posible aplicación clínica, actividad de unión a tumor in vivo de estos anticuerpos se evalúa utilizando el sistema de formación de imágenes fluorescente in vivo con fluorescencia casi infrarroja además del método convencional con radionúclidos. Aquí, revelamos la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales anti-FZD10 in vitro e in vivo así como también la internalización de estos anticuerpos en las células que expresan FZD10, y se encuentra que ratones de xenoinjerto que llevan SYO-1 tratados con la vena de la cola única de marcado con anti-FZD 90Y 10 Mab en dosis 100 mCi se observa efecto antineoplásico significativo.

Con base en los hallazgos anteriores, los presentes inventores concluyeron que los anticuerpos monoclonales de murino contra FZD 10 tienen potencial terapéutico en el tratamiento y diagnóstico de SS y otros tumores que sobreexpresan FZD10.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento del mismo que se une a la proteína FZD10 y en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 92-13 (FERM BP-10628) .

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo, y anticuerpo de cadena sencilla.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón. Preferiblemente, el anticuerpo de ratón comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 50 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 60. Por ejemplo, el anticuerpo de ratón se puede producir por el clon de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628) .

En una realización preferida alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

Más preferiblemente, el anticuerpo quimérico comprende una región V de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 y una región V de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 46 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 48.

En una realización, el anticuerpo quimérico comprende adicionalmente una región de anticuerpo C humana (constante) .

En una realización preferida alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende adicionalmente una región de anticuerpo FR humana (estructura principal) y/o una región C de anticuerpo humano.

En todavía una realización alternativa, el anticuerpo o fragmento del mismo se puede marcar con una marca de radioisótopo o un marca fluorescente. Dicha marca de radioisótopo incluye 90itrio (90Y) , 125yodo (125I) y 111indio (111In) .

La presente invención proporciona adicionalmente un clon de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628) que produce el anticuerpo monoclonal de ratón 92-13.

La invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención para uso en un método para tratar o evitar una enfermedad que se asocia con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) en un sujeto, dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un conjugado de dicho anticuerpo o fragmento con un fármaco antineoplásico o radionucleótido, en donde la enfermedad que se asocia con FZD10 se selecciona de sarcoma sinovial (SS) , cáncer colorrectal, cáncer gástrico, leucemia mieloide crónica (CML) , y leucemia mieloide aguda (AML) .

La presente invención proporciona adicionalmente un método para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad que se asocia con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) o de una predisposición de desarrollar la enfermedad en un sujeto, que comprende

(a) poner en contacto una muestra o un espécimen del sujeto con el anticuerpo o fragmento anterior;

(b) detectar la proteína FZD10 en la muestra o espécimen; y

(c) juzgar si o no el sujeto sufre de o está en riesgo de desarrollar la enfermedad con base en la abundancia relativa de la proteína FZD10 comparado con un control, en donde la enfermedad... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento del mismo que se une a la proteína FZD10 y en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las CDR del anticuerpo monoclonal de rató.

9. 13 (FERM BP-10628) .

2. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 que es un anticuerpo quimérico que comprende:

(i) una región V de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 y una región V de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21; o

(ii) una cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 46 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 48.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo quimérico que comprende adicionalmente una región de anticuerpo C humana (constante) o que es un anticuerpo humanizado que comprende adicionalmente una región de anticuerpo FR humana (estructura principal) y/o una región C de anticuerpo humano.

4. Un anticuerpo monoclonal de ratón o fragmento del mismo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 58 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 60.

5. El anticuerpo monoclonal de ratón o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 4 que se produce por el clon de hibridom.

9. 13 (FERM BP-10628) .

6. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se marca con una marca de radioisótopo o una marca fluorescente.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la marca de radioisótopo se selecciona de 90itrio (90Y) , 125yodo (125I) y 111indio (111In) .

8. Un clon de hibridom.

9. 13 (FERM BP-10628) que produce el anticuerpo monoclonal de rató.

9. 13.

9. Un anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en un método para tratar o evitar una enfermedad que se asocia con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) en un sujeto, dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un conjugado de dicho anticuerpo o fragmento con un fármaco antineoplásico o radionucleótido, en donde la enfermedad que se asocia con FZD10 se selecciona de sarcoma sinovial (SS) , cáncer colorrectal, cáncer gástrico, leucemia mieloide crónica (CML) , y leucemia mieloide aguda (AML) .

10. Un método para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad que se asocia con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) o de una predisposición de desarrollar la enfermedad en un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra o un espécimen del sujeto con dicho anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

(b) detectar la proteína FZD10 en la muestra o espécimen; y

(c) juzgar si o no el sujeto sufre de o está en riesgo de desarrollar la enfermedad con base en la abundancia relativa de la proteína FZD 10 comparado con un control, en donde la enfermedad que se asocia con FZD 10 se selecciona de sarcoma sinovial (SS) , cáncer colorrectal, cáncer gástrico, leucemia mieloide crónica (CML) , y leucemia mieloide aguda (AML) .

11. El anticuerpo de la reivindicación 6 o 7 para uso en un método para formación de imágenes in vivo de la proteína de homólogo Frizzled 10 (FZD10) en un sujeto, dicho método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de dicho anticuerpo.

12. Una composición farmacéutica para tratar o evitar una enfermedad asociada con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) , que comprende un conjugado del anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con un fármaco antineoplásico o radionucleótido y un portador o excipiente farmacéuticamente

aceptable, en donde la enfermedad que se asocia con FZD10 se selecciona de sarcoma sinovial (SS) , cáncer colorrectal, cáncer gástrico, leucemia mieloide crónica (CML) , y leucemia mieloide aguda (AML) .

13. Un equipo para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad asociada con el homólogo Frizzled 10 (FZD10) , que comprende el anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la enfermedad que se asocia con FZD 10 se selecciona de sarcoma sinovial (SS) , cáncer colorrectal, cáncer gástrico, leucemia mieloide crónica (CML) , y leucemia mieloide aguda (AML) .

14. Un método para producir un anticuerpo quimérico contra FZD10 que comprende:

(a) aislar el mARN del clon de hibridom.

9. 13 (FERM BP-10628) ;

(b) sintetizar el cADN de región V de cadena pesada y ligera del mARN aislado utilizando una transcriptasa inversa;

(c) amplificar dicho cADN utilizando PCR;

(d) ligar el ADN de región V amplificada y El ADN que codifica una región C humana para producir un vector de expresión; y

(e) introducir el vector de expresión dentro de un anfitrión para producir el anticuerpo quimérico.

15. El método de la reivindicación 14, en donde los cebadores utilizados para amplificar dicho cADN de la región V de cadena pesada y dicha región V de cadena ligera utilizando PCR tienen las secuencias de nucleótidos de:

(a) SEQ ID NOS: 5 y 6 para dicha región V de cadena pesada; y

(b) SEQ ID NOS: 7 y 8 para dicha región V de cadena ligera.

16. Un método para producir un anticuerpo humanizado contra FZD10 que comprende:

(a) diseñar una secuencia de ADN en la que los CDR del anticuerpo de ratón derivados del anticuerpo monoclonal de rató.

9. 13 (FERM BP-10628) se ligan a las regiones de estructura principal humanas (FR) ;

(b) sintetizar dicha secuencia de ADN mediante un método PCR utilizando cebadores que tienen regiones superpuestas en las regiones terminales de las CDR y FR;

(c) ligar el ADN sintetizado resultante al ADN que codifica una región C de anticuerpo humano;

(d) integrar el producto de ligado dentro de un vector de expresión; y

(e) introducir dicho vector de expresión dentro de un anfitrión y producir por lo tanto el anticuerpo humanizado.