Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo de unión al antígeno de membrana específico de la próstata, sus conjugados y usos.

Un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) que se une a un anticuerpo monoclonal D2/B aislado caracterizado porque comprende una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de las regiones variables VH y VK de la SEQ ID NO: 1 y 2.

Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo de unión al antígeno de membrana específico de la próstata, sus conjugados y usos Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a fragmentos de unión al antígeno de los mismos definidos como scFv a partir de ahora en el presente documento, como reactivos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores de próstata y la erradicación/detección de las células que expresan elevados niveles de antígenos de membrana específicos de próstata, denominados como PSMA a partir de ahora en el presente documento.

El cáncer de próstata es la forma más frecuente de cáncer en varones (seguido por el cáncer de pulmón) y representa la segunda causa de muerte debida a tumor.

Tras el inicio, el cáncer de próstata es un tumor confinado al órgano; la eliminación quirúrgica de la próstata y de las vesículas seminales y la radioterapia son eficaces en el tratamiento de esta forma de tumor.

Sin embargo, cuando el tumor se diagnostica en una etapa avanzada y en los casos en los que la enfermedad evoluciona a formas metastásicas más agresivas e independientes de andrógenos, el uso de diferentes soluciones farmacológicas no es eficaz.

En estos casos, pueden resultar por tanto útiles nuevas estrategias terapéuticas basadas en la inmunoterapia pasiva y en anticuerpos monoclonales específicos (moAbs) para tratar estas formas de cáncer de próstata avanzadas y metastásicas.

Para aplicar esta terapia, es necesario identificar los antígenos asociados a tumores (AAT) , es decir, las moléculas que se expresan en exceso por el tejido neoplásico y que se pueden usar potencialmente como dianas para la terapia inmunológica.

Recientes estudios sugieren que el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) puede representar el antígeno ideal diana en el cáncer de próstata debido a sus características.

PSMA es una glicoproteína de aproximadamente 100 kDa con un dominio intracelular corto (aminoácidos 1-18) , un dominio transmembrana (aminoácidos 19-43) y un dominio extracelular (aminoácidos 44-750) . PSMA se expresa en células epiteliales prostáticas tanto normales como cancerosas, aunque con un nivel de expresión que está considerablemente aumentado en el cáncer de próstata; este nivel tiende a aumentar con la gravedad y progresión de la enfermedad.

Por otra parte, los tejidos extraprostáticos normales, tales como por ejemplo, los túbulos proximales del riñón, el duodeno y el colon tienen una expresión del antígeno PSMA limitada.

Como diana de inmunoterapias antitumorales, PSMA tiene la ventaja de expresarse principalmente en la próstata y de ser una proteína transmembrana presente sobre la superficie celular e internalizada desde la membrana celular a través de vesículas endocíticas revestidas con clatrina. Estas características permiten usar PSMA para la terapia con inmunotoxinas. De forma ventajosa, la unión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos al dominio extracelular promueve este proceso de endocitosis.

Antecedente de la técnica Se conocen muchos anticuerpos monoclonales que se unen a PSMA. Por ejemplo, 7E11, que ha sido homologado por la FDA para el estudio de metástasis que expresa PSMA, es un anticuerpo monoclonal que se une a la porción intracelular de PSMA. Desafortunadamente, 7E11 no se une a células viables, sino solo a células necróticas o apoptóticas en el interior de una masa tumoral.

Se han producido posteriormente anticuerpos monoclonales tales como J591, J415, J533 y E99. Estos anticuerpos reconocen epítopos en el dominio extracelular de PSMA y se unen por tanto a células viables.

J591 se ha usado en particular para diversos estudios in vitro y en modelos animales de forma diagnóstica y terapéutica y sigue estando bajo estudio clínico experimental.

Finalmente, el documento EP1726650 da a conocer otro anticuerpo monoclonal y un fragmento scFv del mismo que se une a PSMA.

A partir de ahora en el presente documento, el término “fragmento del anticuerpo de unión al antígeno” indica uno o más fragmentos de este anticuerpo que mantienen/mantiene la capacidad de unirse específicamente a PSMA.

Breve descripción de los dibujos Para una mejor comprensión de la presente invención, esta se describe ahora también con referencia a las figuras que la acompañan, en las que:

- La figura 1 muestra una transferencia Western llevada a cabo en un lisado de células LNCaP (PSMA+) y PC-3 (PSMA-) , usando moAb D2/B y un anticuerpo J591 (dado ya ampliamente a conocer en la bibliografía) como control;

- la figura 2 muestra una transferencia Western llevada a cabo en un lisado de células LNCaP (PSMA+) y células PC-3, que no expresan la diana antigénica del PSMA, usando scFv D2/B;

- la figura 3a-d muestra los análisis citofluorimétricos de D2/B y scFv D2/B en células PSMA+;

- la figura 4a-d muestra los análisis citofluorimétricos de D2/B y scFv D2/B en células PSMA-;

- la figura 5 muestra una comparación de la capacidad de unión a células LNCaP (PSMA+) de Ab J591, Ab D2/B, scFv D2/B;

- la figura 6 muestra la formación de imágenes in vivo con un Ab D2/B conjugado con el fluoróforo Cy5.5.

Divulgación de la invención Es un objetivo de la presente invención encontrar nuevos anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cáncer de próstata que sean selectivos para células tumorales, permitan un diagnóstico más fácil y más preciso y representen opciones terapéuticas que permitan afectar verdaderamente la biología de la enfermedad en una etapa avanzada y metastásica con el fin de hacer frente más eficazmente a un problema social y médico cada vez mayor que tiene perspectivas de solución inciertas con las actuales medidas terapéuticas.

De acuerdo con la presente invención, este objetivo se consigue mediante un anticuerpo monoclonal aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, uno de sus conjugados de acuerdo con la reivindicación 5, una composición farmacéutica que comprende el mismo de acuerdo con la reivindicación 11. Se proporciona también el uso del anticuerpo y de uno de sus fragmentos, del conjugado y de la composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 12 y 14.

Descripción detallada de la invención En las células prostáticas, PSMA se expresa con una estructura terciaria y cuaternaria específicas y los anticuerpos obtenidos con un PSMA aislado y desnaturalizado no reconocen eficazmente el PSMA expresado en las células tumorales. Los anticuerpos y sus fragmentos de acuerdo con la presente invención se unen ventajosamente a PSMA en su forma natural con una elevada afinidad y pueden por tanto usarse eficazmente en el tratamiento y el diagnóstico. En particular, los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de acuerdo con la invención se unen selectivamente a PSMA reduciendo de esta forma los efectos secundarios de un tratamiento no selectivo.

Los fragmentos de anticuerpos usados son fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) que tienen un tamaño más pequeño y una inmunogenicidad más baja comparados con el anticuerpo correspondiente. Sin embargo, en virtud del tamaño pequeño y de la afinidad más baja por el antígeno, muestran un aumento de la permeabilidad en la microcirculación y una mejor interacción con el antígeno en el sitio de unión del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos comprenden un nucleótido peculiar y una secuencia de aminoácidos en las regiones variables VH y VK que determinan la especificidad y la afinidad de los mismos. Las secuencias de nucleótidos del moAb D2/B y del fragmento scFv del mismo se indican como la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4. La secuencia especificada codifica un fragmento de anticuerpo que tiene una buena capacidad de unión con el antígeno PSMA diana.

El anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos, tal como se ha dado a conocer anteriormente, se puede conjugar con un principio activo para obtener compuestos que se pueden usar para radioinmunoterapia o formación de imágenes o también inmunotoxinas recombinantes.

El principio activo es preferiblemente un agente de marcado, de forma más preferible un radionucleido seleccionado entre 188Re, 131I, 125I, 123I, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, o nanopartículas fluorescentes.

Como alternativa, el anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos se puede conjugar con un agente citotóxico, seleccionado preferiblemente entre PE40, una cadena de ricina A, diantina, saporina.

Finalmente, el anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos se puede conjugar con biotina para aprovechar la elevada... [Seguir leyendo]

1. Un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) que se une a un anticuerpo monoclonal D2/B aislado caracterizado porque comprende una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de las regiones variables VH y VK de la SEQ ID NO: 1 y 2.

2. Un fragmento de anticuerpo D2/B scFv que se une a un antígeno, caracterizado porque comprende una proteína codificada por una secuencia de al menos 741 nucleótidos consecutivos que caracteriza las regiones variables VH y VL de la SEQ ID NO: 3 que se unen a un antígeno.

3. El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el PSMA se une en su forma natural sobre la superficie de células tumorales

4. El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se une selectivamente al PSMA.

5. Un conjugado entre principio activo y anticuerpo que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en un agente de marcado, un agente citotóxico o un vehículo.

6. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho agente de marcado es un radionucleido o nanopartículas fluorescentes.

7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque dicho agente de marcado se selecciona entre el grupo que consiste en 188Re, 131I, 125I, 123I, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu.

8. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho agente citotóxico es PE40, la cadena de ricina A, saporina y diantina.

9. El conjugado scFv D2/B-PE40 de la SEQ ID NO: 5.

10. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho vehículo es biotina o nanopartículas.

11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

12. Uso de un anticuerpo monoclonal aislado o de un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de un tumor.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque dicho tumor es un tumor de próstata.

14. Anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para el uso en la angiogénesis de células PSMA+ de los tumores de cualquier histotipo.