Análisis de resistencia a fármacos de tipo equinocandinas.

Un ensayo de ácido nucleico para la resistencia a fármacos del tipo equinocandinas en hongos susceptibles a losfármacos del tipo equinocandinas que contienen el gen FKS1 correspondientes a la subunidad 1 - 3β

- D - glucanosintetasa de Fks1p que se compone de una primera secuencia diana de ácido nucleico del gen FKS1correspondiente a los aminoácidos 636 a 654 de CaFks1p o cualquier área más pequeña de esa secuencia queincluya los aminoácidos 641 a 649 para generar una primera secuencia diana amplificada con sondas de hibridaciónmarcadas específicas para las mutaciones aminoácidas S645P, S645Y y S645F de CaFks1p, y detectar la presentade cualquiera de estas mutaciones en dicha primera secuencia diana amplificada.

Análisis de resistencia a fármacos de tipo equinocandinas [0001] La presente invención describe ensayos de ácido nucleico en hongos.

Las infecciones fúngicas son una causa significativa de morbilidad y mortalidad en numerosos pacientes enfermos; y su impacto resulta exacerbado debido a la falta de diagnóstico rápido y de tratamiento efectivo de estas infecciones. El uso generalizado de agentes antifúngicos ha sido el resultado de la selección de especies naturalmente resistentes a los hongos, así como de la aparición de resistencia en especies susceptibles. El tratamiento de las enfermedades fúngicas se ve obstaculizado por la escasa disponibilidad de fármacos antifúngicos. Recientemente se ha presentado Caspofungin como el primer fármaco de una nueva clase de equinocandinas que se dirige a la pared celular fúngica inhibiendo la síntesis de º - (1 - 3) – D - glucano. La utilización de Caspofungin se está expandiendo rápidamente, y se están presentando aislados clínicos de especies de Candida con susceptibilidad in vitro reducida que muestran una correlación muy alta entre la falta de tratamiento y los altos niveles de concentración inhibitoria mínima in vitro, o CMI. Puesto que la exposición del paciente a Caspofungin aumenta y que las demás equinocandinas, incluyendo Micafungin y Anidulafungin, se encuentran comercialmente disponibles, se prevé un aumento del número de aislados clínicos con valores elevados de CMI.

Un aspecto de la presente invención son los ensayos de ácido nucleico que detectan las mutaciones genéticas asociadas a hongos resistentes a las equinocandinas, incluyendo de manera no limitante los hongos del género Candida.

Otro aspecto de la presente invención son dicho ensayos de ácido nucleico que emplean la amplificación de ácido nucleico exponencial de regiones específicas que codifican la proteína FKS1, preferiblemente acoplados por secuenciación o detección utilizando sondas marcadas discriminantes de alelos.

Otro aspecto de la presente invención son los kits de reactivos y los conjuntos de oligonucleótidos de cebadores y sondas para llevar a cabo los ensayos anteriores.

Se han realizado trabajos previos que consideran aspectos de las regiones específicas que codifican FKS1, como THOMPSON ET AL., :”A Glucan Synthase FKS1 Homolog in Cr y ptococcus neoformans Is Single Copy and Encodes and Essential Function” [J. OF BACTERIOLOGY vol. 181, nº 2, Enero 1999, página 452], y la patente EP931834; sin embargo, ninguno ha presentado un ensayo efectivo sobre la resistencia a los fármacos de tipo equinocandinas como se propone en este documento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención, se presenta un ensayo de ácidos nucleicos para determinar la resistencia a fármacos de tipo equinocandinas en hongos susceptibles a fármacos de tipo equinocandinas y que contienen el gen FKS1 correspondiente a la subunidad de Fks1p 1 - 3 º – D - glucano sintetasa que comprende la amplificación de una primera secuencia diana de ácido nucleico del gen FKS1 correspondiente a los aminoácidos 636 a 654 de CaFks1p o a cualquier área de esa secuencia que incluya los aminoácidos 641 a 649 para generar una primera secuencia diana amplificada, poniendo en contacto la primera secuencia diana amplificada con sondas de hibridación específica marcadas para las mutaciones aminoácidas S645P, S645Y y S645F de CaFks1p; y para detectar la presencia de cualquiera de estas mutaciones en dicha primera secuencia diana amplificada.

Según la presente invención, también se presenta un conjunto de oligonucleótidos que incluye un primer par de cebadores hacia adelante e inversos que amplifican una primera secuencia diana del gen FKS1 correspondiente a la subunidad de Fks1p 1 – 3 º – D – glucano sintetasa, correspondiente a su vez a, al menos, parte de la secuencia que incluye los aminoácidos 641 a 649, y sondas marcadas de hibridación discriminantes de alelos que se hibridan selectivamente a las mutaciones T1933C, C1934A y C1934T.

Las equinocandinas son los primeros y más importantes fármacos antifúngicos en estar disponibles comercialmente en décadas. El mantenimiento de la integridad de la pared celular fúngica es esencial, ya que un hongo no puede sobrevivir sin esta estructura, o incluso si esta se encuentra notablemente alterada de alguna manera. La pared es una matriz extracelular de estructura en capas consistente en una capa externa de glicoproteínas y una capa interna de polímeros de hidratos de carbono que incluyen glucano, quitina y galactomanano. En los hongos saprófitos y patógenos, la capa de carbohidratos se compone en su mayoría de º (1

- 3) - glucano y a (1 - 3) - glucano, pero también contiene algunos º (1 - 6) - glucanos y quitina. Los glucanos también se liberan a la sangre a través de la pared celular fúngica como exopolímeros en pacientes con infecciones fúngicas, y se sabe que activan un amplio rango de respuestas autoinmunes innatas. La pared celular fúngica es una estructura dinámica, puesto que los polímeros que la constituyen son químicamente modificados constantemente y se reorganizan durante la biosíntesis de la pared celular. Por ejemplo, es bien conocido que Fks1p, la presunta subunidad catalítica del complejo glucano sintetasa responsable de la formación de º (1 – 3) -glucano, se localiza en acúmulos de actina cortical. Se mueve sobre la superficie de la célula a las zonas de remodelación de la pared celular, y las células con Fks1p inmovilizada muestran la estructura y la función defectuosas de la pared celular. Fks1p es el producto del gen FKS1. Las equinocandinas son hexapéptidos cíclicos N - acilados con cadena de ácidos grasos e inhiben laº (1 - 3) – D - glucano sintetasa, responsable de la biosíntesis del biopolímero principal de la pared celular. Los fármacos de tipo equinocandinas, caspofungin, micafungin y anidulafungin son los primeros de una nueva clase de componentes antifúngicos que se dirigen a la pared celular fúngica inhibiendo la º (1 – 3) - glucano sintetasa. La seguridad y la tolerabilidad de caspofungin, el primer fármaco aprobado, en el tratamiento de infecciones fúngicas se ha analizado en ciertos estudios recientes, sin que la mayoría de los pacientes sufrieran efectos adversos clínicos o de laboratorio graves.

Estos fármacos tienen un amplio espectro de actividad antifúngica contra las especies de Candida y Aspergillus sin resistencia cruzada a agentes antifúngicos existentes y, por lo tanto, son efectivos contra las levaduras y los mohos resistentes a los azoles. Más importante es que, debido a su influencia crítica en la pared celular, las equinocandinas actúan como fungicidas contra las levaduras. Son activas contra los mohos, pero solo parecen inhibir las puntas de crecimiento de las hifas. Sin embargo, son menos activas contra las especies invasivas de Zygomycetes, Cr y ptococcus neoformans o Fusarium. No obstante, son altamente efectivas clínicamente contra las especies de Aspergillus. Caspofungin ha sido aprobado en E.E.U.U. y otros países para el tratamiento de numerosas infecciones fúngicas graves, incluyendo la aspergillosis invasiva en pacientes refractarios o intolerantes a otras terapias, candidiasis esofágica, candidemia y otras infecciones por Candida (incluyendo abscesos intraabdominales, peritonitis e infecciones en el espacio pleural) . Caspofungin también está indicado en terapias empíricas de posibles infecciones fúngicas en pacientes con fiebre persistente y neutropenia. En la actualidad, caspofungin se utiliza frecuentemente junto a triazoles, como el voriconazol, en terapias antifúngicas primarias contra levaduras y mohos. La aparición de fármacos similares a micafungin y anidulafungin ampliará el alcance de esta nueva clase de fármacos altamente eficaces en la comunidad clínica.

Desde que la primera equinocandina aprobada entrara en el mercado en 2002, el uso de caspofungin en clínicas ha crecido rápidamente, especialmente como etiqueta para caspofungin en E.E.U.U., donde se expandió recientemente para incluir la candidiasis esofágica, fungemia y otras infecciones por Candida, así como en la terapia empírica. Se han descrito aislados clínicos de Candida con susceptibilidad reducida in vitro a caspofungin y se ha comprobado la correlación entre el fracaso in vivo y el aumento in vitro de los valores de CMI de caspofungin, aunque la estricta correlación entre los valores de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) y el resultado clínico no se ha establecido todavía. Cuando la exposición de un paciente a caspofungin aumenta y micafungin (junio 2005) y anidulafungin entran en el mercado, se anticipa que el número de aislados clínicos con valores... [Seguir leyendo]

pueden llevarse a cabo diferentes modificaciones sin alejarse del espíritu y el alcance de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear procedimientos de amplificación diferentes a la PCR, como NABSA, y sondas discriminantes de alelos diferentes a las sondas de baliza molecular. En consecuencia, otras realizaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

1. Un ensayo de ácido nucleico para la resistencia a fármacos del tipo equinocandinas en hongos susceptibles a los fármacos del tipo equinocandinas que contienen el gen FKS1 correspondientes a la subunidad 1 – 3º – D - glucano sintetasa de Fks1p que se compone de una primera secuencia diana de ácido nucleico del gen FKS1 correspondiente a los aminoácidos 636 a 654 de CaFks1p o cualquier área más pequeña de esa secuencia que incluya los aminoácidos 641 a 649 para generar una primera secuencia diana amplificada con sondas de hibridación marcadas específicas para las mutaciones aminoácidas S645P, S645Y y S645F de CaFks1p, y detectar la presenta de cualquiera de estas mutaciones en dicha primera secuencia diana amplificada.

2. El ensayo de la reivindicación 1 en el que el hongo es una especie de Candida.

3. El ensayo según las reivindicaciones 1 o 2 en el que la etapa de amplificación incluye una segunda secuencia diana de ácido nucleico del gen FKS1 correspondiente a la subunidad 1 – 3 – º – D -glucano sintetasa de Fks1p correspondiente a los aminoácidos 1345 a 1369 de CaFks1p o a cualquier área más pequeña de esa secuencia que incluye los aminoácidos 1357 a 1364 y en la que la etapa de detección incluye la detección de cualquier alelo de tipo salvaje en dicha segunda secuencia diana amplificada.

4. El ensayo de la reivindicación 3 que es capaz de detectar al menos un cambio aminoácido seleccionado del grupo consistente en R1361H y R1361G de CaFks1p.

5. El ensayo de las reivindicaciones 3 o 4 en el que la amplificación de la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana se lleva a cabo en la misma mezcla de reacción.

6. El ensayo de la reivindicación 1 en el que la detección es detección homogénea en tiempo real o en punto final.

7. El ensayo según la reivindicación 6 en el que la detección es detección en tiempo real.

8. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa de amplificación incluye un procedimiento de amplificación seleccionado del grupo consistente en PCR, NABSA y TMA.

9. Un conjunto de oligonucleótidos que incluye un primer par de cebadores hacia adelante e inversos para amplificar una primera secuencia diana del gen FKS1 correspondiente a la subunidad 1 – 3 – – D - glucano sintetasa de Fks1p correspondiente a los aminoácidos 636 - 654 de CaFks1p o a cualquier área más pequeña de esa secuencia que incluya los aminoácidos 641 - 649 y sondas de hibridación discriminantes de alelos marcadas que hibriden las mutaciones T1933C, C1934A y C1934T.

10. El conjunto de oligonucleótidos de la reivindicación 9 que incluye un segundo par de cebadores hacia adelante e inversos para amplificar una segunda secuencia diana del gen FKS1 correspondiente a la subunidad 1 – 3 – º – D glucano sintetasa de Fks1p correspondiente a los aminoácidos 1345 - 1369 de CaFks1p o a cualquier área de esa secuencia que incluya los aminoácidos 1357 – 1364.

11. El conjunto de oligonucleótidos de la reivindicación 9 en el que dicho primer par de cebadores hacia adelante e inversos también abarca los aminoácidos 1357 – 1364 correspondientes a CaFks1p.

12. El conjunto de oligonucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que incluyen, además, sondas de hibridación discriminantes de alelos marcadas que hibridan selectivamente al menos una mutación seleccionada del grupo formado por T1921C, T1922C, G1932T, C1934G, C1942T, y C1946A de CaFKS1.

13. El conjunto de oligonucleótidos de la reivindicación 9 en el que las sondas son sondas de baliza molecular.

14. Un kit de reactivos de amplificación que incluye polimerasa de ADN, dNTPs y un conjunto de oligonucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.

15. El kit de reactivos según la reivindicación 14 incluye, además, reactivos para la preparación de muestras y la extracción de ADN.

16. El ensayo de la reivindicación 1 que incluye la entrada en contacto de la primera secuencia diana amplificada con sondas de hibridación marcadas específicas para al menos una de las mutaciones aminoácidas seleccionadas del grupo formado por F641L y F641S de CaFks1p, y la detección de la presencia de dicha al menos una mutación.

17. El ensayo de las reivindicaciones 1 o 16 en el que la primera secuencia diana es amplificada en reacciones paralelas, conteniendo cada una de ellas una sonda específica a un mutante y una sonda específica para el correspondiente alelo de tipo salvaje.

18. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 16 o 17 en el que las sondas son sondas de baliza molecular.

FIGURA 1A FIGURA 1B

FIGURA 4

Oligonucle ótido Secuencia ab 5’ Modificación 3’ Modificación Objetivo

CAFKS1-F1719 CATTGCTGGGCCACTTTAG Ninguna Ninguna Cebador de secuenciación

CAFKS1-R2212 GATTTCCATTTCCGTGGTAGC Ninguna Ninguna Cebador de secuenciación

HS1SN2 GCCAAATTGGTTGAATCTTA Ninguna Ninguna Cebador de PCR en tiempo real

HS1AN2 GTCATGGTCGACAAGTTTCT Ninguna Ninguna Cebador de PCR en tiempo real

T-WT AAAAATCTCTTAAAGACAAAGTCAAGAAAAAA Ninguna Ninguna Diana de tipo salvaje

T-T1933C AAAAATCTCTTAAAGGCAAAGTCAAGAAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutación de T1933C

T-C1934A AAAAATCTCTTAAATACAAAGTCAAGAAGAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutación de C1934A

T-C1934T AAAAATCTCTTAAAAACAAAGTCAAGAAGAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutación de C1934T

T-T1929A AAAAATCTCTTAAAGACAATGTCAAGAAAAAA Ninguna Ninguna Diana de SNP de T1929A

T-T1929A-T1933C AAAAATCTCTTAAAGGCAATGTCAAGAAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutaciones de T1929A y T1933C

T-T1929A-C1934A AAAAATCTCTTAAATACAATGTCAAGAAGAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutaciones de T1929A y C1934A

T-T1929A-C1934T AAAAATCTCTTAAAAACAATGTCAAGAAGAAAA Ninguna Ninguna Diana de la mutaciones de T1929A y C1934T

HS1-WT CGCGAGTTCTTGACWTTGTCTTTAAGAGATCTCGC G FAM Dabcyl Sonda de tipo salvaje

HS1-T1933C CGCGAGTCTTGACWTTGCCTTTAAGAGATCTCGC G HEX Dabcyl Sonda de mutación T1933C

HS1-C1934A CGCGAGCTTCTTGACWTTGTATTTAAGAGATCTCG CG HEX Dabcyl Sonda de mutación C1934A

HS1-C1934T CGCGAGCTTCTTGACWTTGTTTTTAAGAGATCTCG CG HEX Dabcyl Sonda de mutación C1934T

FIGURA 6B

FIGURA 7