Adsorbentes para la purificación de proteínas.

Uso de un adsorbente de afinidad para la separación, la eliminación,

el aislamiento, la purificación, lacaracterización, la identificación o la cuantificación de un material proteínico, en el que el adsorbente de afinidad esun compuesto de fórmula XI, V, 5 VI, VII, VIII, IX o X **Fórmula**

Adsorbentes para la purificación de proteínas

Campo de la invención Esta invención se refiere a compuestos y a sus usos como ligandos de afinidad para la purificación de proteínas.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos son glicoproteínas de inmunoglobulina que tienen una unidad básica de una estructura monomérica. El monómero es una proteína en forma de Y que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos de las cuales son cadenas pesadas idénticas y dos son cadenas ligeras idénticas conectadas mediante puentes disulfuro. Hay cinco tipos diferentes de cadena pesada γ, μ, α, ε y δ) que distinguen las clases de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgD y

IgE, respectivamente) . También hay dos tipos diferentes de cadena ligera (λ y κ) que resultan de diferentes productos génicos.

La IgG (una inmunoglobulina monomérica de aproximadamente 150 kD de tamaño) proporciona inmunidad basada en anticuerpos frente a patógenos invasores y, debido a la alta especificidad que tiene la IgG hacia antígenos 20 específicos dentro del cuerpo, es el reactivo más comúnmente usado en investigación inmunológica y diagnósticos clínicos.

Anticuerpos monoclonales (en el presente documento denominados AcM) son anticuerpos que tienen especificidad idéntica hacia un único antígeno y se generan a partir de una línea celular que se ha producido a partir de una única célula clonada. Los AcM constituyen el sector de más rápido crecimiento en la industria biofarmacéutica en la que se estima que las ventas alcanzarán los 30 mil millones de $ (EE.UU.) en el 2010. Los títulos de anticuerpos de cultivos celulares de mamíferos han continuado mejorando a lo largo de los últimos 20 años y se requieren adsorbentes de cromatografía y procedimientos posteriores alternativos para solucionar el atolladero del procedimiento en el procesamiento de los AcM.

Los fragmentos de anticuerpos (partes de moléculas de anticuerpos completos) ofrecen varias ventajas con respecto a anticuerpos completos. Son más fáciles y más rentables de fabricar, tienen menos efectos secundarios en pacientes, reduciendo el riesgo de liberación de citocinas y su toxicidad asociada, debido a la ausencia de la región Fc (cadena pesada) , y pueden modificarse para incluir cargas terapéuticas. Hay varios tipos de fragmentos de anticuerpos que son dominios de IgG’ o bien preparados mediante digestión con enzima endopeptidasa específica o bien que se han diseñado por ingeniería genética en líneas celulares. Éstos incluyen fragmentos monovalentes tales como Fab’, Fab y scFv; fragmentos bivalentes tales como minicuerpos y diacuerpos F (ab’) 2; y fragmentos multivalentes tales como triacuerpos y tetracuerpos.

Muchos productos de fragmentos de anticuerpos están en desarrollo para su uso como agentes terapéuticos o en diagnóstico. Se espera que fragmentos de anticuerpos recombinantes tengan una cuota significativa en el mercado de diagnóstico de unos 6 mil millones de $ (EE.UU.) al año, desde inmunoensayos in vitro hasta aplicaciones de obtención de imágenes de tumores o coágulos in vivo (Holliger, P., y Hudson P.J., Nat. Biotech 23 (9; 2005) 11261136) .

La mayoría de los productos de fragmentos de anticuerpos carecen de un sitio de unión a proteína A y por tanto, a diferencia de anticuerpos de cadena completa, no pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad a proteína A. En la mayoría de los casos, se usan técnicas de cromatografía convencionales para purificar fragmentos de anticuerpo. La proteína L, una proteína con un peso molecular de 35000 Dalton derivada de una especie bacteriana 50 de Peptostreptococcus magnus, se sabe que se une a cadenas ligeras de anticuerpos y se ha investigado para la purificación de algunos fragmentos de anticuerpos pero no se considera que sea rentable ni se encuentra disponible en cantidades comerciales.

El documento WO97/10887 da a conocer compuestos a base de triazina, útiles como adsorbentes de afinidad, de 55 fórmula I

en la que: R1 es H, alquilo, hidroxialquilo, ciclohexilo, NH2, fenilo, naftilo, 1-fenilpirazol, indazol, benzotiazol, benzoxazol o bencimidazol, cualquier grupo aromático de los cuales puede estar sustituido con uno o más de alquilo, alcoxilo, aciloxilo, acilamino, amino, NH2, OH, CO2H, sulfonilo, carbamoílo, sulfamoílo, alquilsulfonilo y halógeno;

un X es N y el otro es N, C-Clo C-CN;

Y es O, S o NR2;

Z es O, S o NR3;

R2 y R3 son cada uno H, alquilo, hidroxialquilo, bencilo o β-feniletilo;

Q es benceno, naftaleno, benzotiazol, benzoxazol, 1-fenilpirazol, indazol o bencimidazol;

R4, R5 y R6 son cada uno H, OH, alquilo, alcoxilo, amino, NH2, aciloxilo, acilamino, CO2H, ácido sulfónico, carbamoílo, sulfamoílo, alquilsulfonilo o halógeno;

n es de 0 a 6; 20 p es de 0 a 20; y

A es una matriz de soporte unida opcionalmente al anillo que contiene X mediante un espaciador.

Se da a conocer que compuestos de fórmula I tienen afinidad por proteínas tales como inmunoglobulinas, insulina, factor VII u hormona de crecimiento humana.

Se dan a conocer compuestos de estructura relacionada en los documentos WO 00/67900 y WO 03/097112. Tienen afinidad por endotoxinas.

Determinados compuestos a base de triazina dados a conocer en el documento WO 97/10887 tienen afinidad por inmunoglobulinas. Un ejemplo de un compuesto que muestra tal afinidad es un compuesto de estructura II

Compuestos tales como II pueden separar inmunoglobulinas específicamente de mezclas complejas o materias primas tales como plasma humano.

Otro tipo de materia prima comúnmente encontrada es un sobrenadante de cultivo celular producido industrialmente,

en el que están presentes anticuerpos monoclonales en concentraciones de hasta 5 g/l de sobrenadante. Compuestos tales como II también pueden ser útiles para la eliminación específica de anticuerpo monoclonal de estas mezclas, aunque se sabe que su rendimiento se ve comprometido por la presencia de aditivos de cultivos celulares tales como Pluronic F-68.

Pluronic F-68 es un agente antiespumante comúnmente usado en cultivo de células de mamífero. Es un copolímero de bloque de polioxietileno y polioxipropileno, y tiene un peso molecular de aproximadamente 8000 Da. Se usa Pluronic F-68 para proteger las células del daño por cizallamiento y burbujas de aire, y se usa normalmente en una cantidad de 1 g/l en sobrenadantes de cultivo celular. Su presencia puede reducir o suprimir la capacidad de compuestos tales como II para separar inmunoglobulinas de tales materias primas, lo que representa un obstáculo 50 considerable para el uso de tales ligandos para la captura directa de anticuerpos monoclonales a partir de medios de cultivo de células de mamífero.

Sumario de la invención 55 Sorprendentemente, se ha encontrado que determinados compuestos, muchos de los cuales son novedosos, son útiles para la purificación basada en afinidad de inmunoglobulinas, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos, incluso en presencia de compuestos tales como Pluronic F-68. Los compuestos para su uso en la invención se definen en la reivindicación 1.

Además, los compuestos de la invención incluyen los ligandos correspondientes, en los que A se reemplaza por un grupo funcional, unido directa o indirectamente al anillo de triazina, que puede inmovilizarse sobre una matriz de soporte. Los términos “ligando” y “adsorbente” pueden usarse de manera intercambiable, a continuación.

Descripción de la invención Los documentos WO 97/10887, WO 00/67900 y WO 003/097112 dan a conocer cómo pueden construirse bibliotecas combinatorias de ligandos sobre un soporte sólido. Sus descripciones, incluyendo ejemplos de realizaciones y procedimientos comunes a la presente invención, se incorporan en el presente documento como referencia. Durante el examen de un conjunto de estas bibliotecas combinatorias con una materia prima que contiene albúmina, inmunoglobulinas y Pluronic F-68, se identificó que varios ligandos podían unirse selectivamente a y eluir inmunoglobulinas.

Los compuestos según la reivindicación 1 para su uso en la invención pueden prepararse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Tales procedimientos se describen en las 3 publicaciones PCT identificadas anteriormente; pueden adaptarse fácilmente a la preparación de nuevos compuestos.

Tales compuestos sustituidos son novedosos.

Adsorbentes o ligandos de unión a inmunoglobulinas de la invención son de las fórmulas Los ligandos de unión a inmunoglobulinas descritos en el... [Seguir leyendo]

1. Uso de un adsorbente de afinidad para la separación, la eliminación, el aislamiento, la purificación, la caracterización, la identificación o la cuantificación de un material proteínico, en el que el adsorbente de afinidad es un compuesto de fórmula XI, V, VI, VII, VIII, IX o X

en la que A es una matriz de soporte unida opcionalmente al anillo de triazina mediante un espaciador.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el material proteínico es una inmunoglobulina, fragmento de inmunoglobulina o proteína.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el material es un anticuerpo monoclonal.

4. Uso según la reivindicación 2, en el que el material es un fragmento de inmunoglobulina seleccionado de fragmentos Fab, Fab’, F (ab’) 2, scFV, de diacuerpo, minicuerpo, tricuerpo y tetracuerpo.

5. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el material proteínico está en cultivo celular.

6. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el material proteínico está en combinación con un agente antiespumante.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el agente antiespumante es un copolímero de bloque de polioxietileno y polioxipropileno.

8. Compuesto según la reivindicación 1.