Virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno delvirus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental,

siendo dicho virus recombinante del sarampión el producto dela expresión en una célula de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNcque codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión(MV) originaria de la cepa Schwarz, donde dicha molécula de ADNc se recombina con una secuencia heteróloga denucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o elvirus del Nilo occidental, y siendo capaz dicho virus recombinante del sarampión de provocar una respuesta inmunehumoral y/o a celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidentalo tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna

La invención se refiere a virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental y a su uso para la preparación de composiciones de vacuna.

El virus del sarampión es un miembro del orden mononegavirales, es decir, virus con un genoma ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV del inglés "measles virus") tiene una polaridad antimensaje que produce un ARN genómico que no se traduce in vivo o in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.

Se ha estudiado la transcripción y replicación de virus ARN de cadena (-) no segmentada y su ensamblaje como partículas virales y se ha presentado especialmente en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al.) . La transcripción y replicación del virus del sarampión no implican el núcleo de las células infectadas sino que en cambio tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales a partir de los seis genes (denominados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales a partir del gen P. El orden de los genes es el siguiente: 3'-I, N, P (incluyendo C y V) , M, F, H, y la proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende adicionalmente regiones no codificantes en la región intergénica IWF; esta región no codificante contiene aproximadamente 1000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I) , las proteínas de la nucleocápsida del virus, es decir, la nucleoproteína (N) , la fosfoproteína (P) , y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico para proporcionar la nucleocápsida. Los otros genes codifican las proteínas de la envuelta viral incluyendo las proteínas hemaglutinina (H) , de fusión (F) y de matriz (M) .

Se ha aislado el virus del sarampión y se han obtenido vacunas vivas atenuadas del aislado del MV Edmonston en 1954 (Enders, J. F., y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.) , por pases en serie en células renales o amnióticas humanas primarias. Las cepas usadas después se adaptaron para fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) para producir semillas Edmonston A y B (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.) , Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) . Edmonston B se autorizó en 1963 como la primera vacuna contra el MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en FEP produjeron los virus Schwarz y Moraten más atenuados (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.) , Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha demostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920) . Como la vacuna Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se remplazó por la vacuna Schwarz/Moraten que es actualmente la vacuna contra el sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine. 20: 651-665) . También se usan otras varias cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia, y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no se obtuvieron de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en FEP. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI38) .

La vacuna viva atenuada obtenida de la cepa Schwarz está comercializada por Aventis Pasteur (Lyon Francia) con el nombre comercial Rouvax®.

En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y sus colegas clonaron el ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético original y eficaz para recuperar el virus correspondiente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen, y M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y documento WO 97/06270. Desarrollaron un vector Edmonston para la expresión de genes foráneos (Radecke, F., y M. Billeter. 1997. Reverse genetics meets the nonsegmented negative-strand RNA viruses. Reviews in Medical Virology. 7:49-63.) y demostraron su gran capacidad de inserción (hasta 5 kb) y su alta estabilidad en la expresión de transgenes (Singh, M., y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing biologically active human interleukin-12. J. Gen. Virol. 80:101-106; Singh, M., R. Cattaneo, y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol. 73:4823-4828; Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter, y H. Nairn. 1998. Chimeric measles viruses with a foreign envelope. J. Virol. 72:2150-2159) ; Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter, y H. Nairn. 2001. Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps and simian immunodeficiency viruses. Vaccine. 19:2329-2336. Este vector se clonó a partir de la cepa Edmonston B del MV propagado en células HeLa (Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S.

A. Udem, y M. A. Billeter. 1990. Infectious measles virus from cloned cDNA. Embo J. 9:379-384) .

Además, se ha producido virus recombinante del sarampión que expresa el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y ha demostrado inducir respuestas inmunes humorales en ratones genéticamente modificados (Singh M. R. et al., 1999, J. virol. 73: 4823-4828) .

La vacuna contra el MV induce una inmunidad muy eficaz, de por vida después de una única inyección de baja dosis (104 DICT50) (33, 34) . La protección está mediada tanto por anticuerpos como por células T CD4+ y CD8+. El genoma del MV es muy estable y nunca se ha observado reversión a patogenicidad con esta vacuna. El MV se replica exclusivamente en el citoplasma, descartando la posibilidad de integración en el ADN del hospedador. Además, se ha establecido un clon de ADNc infeccioso correspondiente al anti-genoma de la cepa Edmonston del MV y un procedimiento para recuperar el virus correspondiente (35) . Este ADNc se ha creado en un vector para expresar genes foráneos (36) . Puede albergar hasta 5 kb de ADN foráneo y es genéticamente muy estable (37, 38, 39) .

A partir de la observación de que las propiedades del virus del sarampión y especialmente su capacidad de provocar elevados títulos de anticuerpos neutralizantes in vivo y su propiedad de ser un potente inductor de respuestas inmunes celulares de larga duración, los inventores han propuesto que puede ser un buen candidato para la preparación de composiciones que comprendan virus recombinantes infecciosos que expresen péptidos o polipéptidos antigénicos de determinados virus ARN, incluyendo especialmente retrovirus o flavivirus, para inducir anticuerpos neutralizantes contra dicho virus ARN y especialmente dichos retrovirus o flavivirus que podrían ser preferiblemente adecuados para conseguir al menos algún grado de protección contra dichos virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus, en animales y más preferiblemente en hospedadores humanos. Especialmente, las cepas de MV y en particular las cepas de vacuna se han elegido en la presente invención como vectores candidatos para inducir inmunidad tato contra el virus del sarampión como contra virus ARN cuyo constituyente se expresa en el MV recombinante diseñado, en poblaciones de bebés expuestos porque ellos no tienen inmunidad contra el MV. Las poblaciones adultas, incluso individuos ya inmunizados contra el MV, sin embargo, también pueden beneficiarse de la inmunización con MV recombinante porque la readministración del virus MV en forma recombinante de la presente... [Seguir leyendo]

1. Virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, siendo dicho virus recombinante del sarampión el producto de la expresión en una célula de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión (MV) originaria de la cepa Schwarz, donde dicha molécula de ADNc se recombina con una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, y siendo capaz dicho virus recombinante del sarampión de provocar una respuesta inmune humoral y/o a celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental

o tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.

2. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 1, que se recupera de células auxiliares transfectadas con una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, y cumpliendo dicha secuencia de nucleótidos recombinante la regla de seis.

3. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula de ADNc comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio de 2002 con el Nº I-2889, donde dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión.

4. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia de nucleótidos recombinante es del inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw2-gfp depositado el 12 de junio de 2002 con el número I-2890 (CNCM) , donde la secuencia del gen gfp está sustituida por una secuencia que codifica una determinada secuencia de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.

5. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, donde la molécula de ADNc se selecciona entre las siguientes secuencias:

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11

6. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos es de un antígeno del virus de la fiebre amarilla seleccionado entre las proteínas de envuelta (Env) o NS1 o mutantes inmunogénicos de las mismas.

7. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos es de un antígeno del virus del Nilo occidental seleccionado entre la envuelta (E) , la premembrana (preM) o mutantes inmunogénicos de las mismas.

8. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaz de inducir protección contra VLP o proteínas pM/E heterólogas.

9. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que provoca una respuesta inmune humoral y/o celular en un modelo animal susceptible al virus del sarampión.

10. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un modelo animal de mamífero susceptible al virus del sarampión.

11. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un mamífero.

12. Vector del virus recombinante del sarampión que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión unida de forma funcional a (ii) secuencias de control de la expresión y (iii) una secuencia heteróloga de ADN que codifica una determinada secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental,

clonándose dicha secuencia heteróloga de ADN en dicho replicón en condiciones que permiten su expresión y teniendo dicho replicón una cantidad total de nucleótidos que cumple la regla de seis, donde la secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigénico de MV es originaria de la cepa Schwarz.

13. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde la secuencia heteróloga de ADN se clona dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc que codifica el ARN antigenómico de dicho virus recombinante del sarampión.

14. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU se elige corriente arriba del gen N del virus MV.

15. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU se elige entre los genes P y M del virus MV.

16. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU está entre los genes H y L del virus MV.

17. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde la secuencia heteróloga de ADN se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas de MV.

18. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde la secuencia heteróloga de ADN no se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas de MV.

19. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, donde el antígeno mutado posibilita la exposición de epítopos neutralizantes.

20. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, donde el ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión y la secuencia de control de la expresión son de pTM-MVSchw depositado en el CNCM con el Nº I-2889.

21. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, que es un plásmido.

22. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, donde el replicón se diseña de acuerdo con el mapa de la figura 2 donde « inserto » representa la secuencia heteróloga de ADN.

23. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, donde la secuencia heteróloga de ADN se selecciona entre YFV17D204.

24. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, donde la secuencia heteróloga de ADN se selecciona entre la cepa neurovirulenta IS-98-ST1.

25. Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 20, que se selecciona entre los siguientes vectores depositados en el CNCM

pTM-MVSchw2-Es WNV CNCM I-3033 pTM-MVSchw2-GFPbis - CNCM I-3034 pTM-MVschw3-GFP CNCM I-3037 pTM-MVSchw2-Es YFV CNCM I-3038.

26. Un sistema de recuperación para el ensamblaje de virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, que comprende una determinada célula transfectada con un vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25, y una determinada célula auxiliar recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del virus del sarampión.

27. Una composición inmunogénica que comprende un virus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25.

28. Una composición de vacuna que comprende un virus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25.