Utilización de secuencias de adn de estructura triple para la transferencia de secuencias nucleotídicas.

Vector recombinante lentiviral caracterizado por que está destinado a ser transcomplementado por las secuencias que codifican los polipéptidos GAG,

POL y ENV o una parte de estos polipéptidos suficiente para permitir la formación de partículas de vector lentivirales, y por que comprende:

a) señales de regulación de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral,

b) un polinucleótido derivado de un genoma lentiviral en el que es capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa, siendo dicho polinucleótido una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS), y

c) una secuencia de nucleótidos de interés situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión de origen no retroviral.

Utilización de secuencias de ADN de estructura triple para la transferencia de secuencias nucleotídicas.

La presente solicitud tiene por objeto la utilización de secuencias de ADN susceptibles de presentar una estructura u organización con tres cadenas (llamada “ADN triple”) , para la transferencia de secuencias de nucleótidos a las 5 células, así como de los vectores recombinantes que contienen estas secuencias triples.

La invención tiene por objeto, por lo tanto, la definición y el suministro de nuevos medios susceptibles de ser empleados, por ejemplo, en el marco de protocolos de terapia génica o de transgénesis para la creación de animales o de plantas transgénicas o también de células o líneas celulares recombinantes. Estos medios comprenden la elaboración de nuevos vectores susceptibles de transferir una secuencia de nucleótidos y, en particular, una secuencia de interés terapéutico, a células diana del cuerpo humano o animal.

Una limitación importante de los enfoques de terapia génica conocidos hasta ahora, se basa en la vectorización del gen de interés terapéutico Los vectores retrovirales derivados de oncovirus, principalmente del VLMMo, han sido ampliamente utilizados para la transferencia de genes. Su aplicación está muy limitada por el hecho de que los oncovirus solamente se integran en células diana en división activa. Por el contrario, los lentivirus tienen la capacidad única, entre los retrovirus, de infectar células diferenciadas, no mitóticas, y representan candidatos virales interesantes para el desarrollo de nuevos vectores. Al tiempo que conservan las ventajas de un vector oncoviral (ausencia de inmunogenicidad, integración estable) , los vectores lentivirales podrían permitir la transducción in vivo de tejidos diferenciados no mitóticos (cerebro, músculo, hígado, pulmón...) y encontrar de este modo un campo de aplicación considerable en terapia génica.

Se han descrito diferentes tentativas de construcción de vectores retrovirales a partir de lentivirus. Se mencionarán a este respecto los trabajos de Poznansky M. et al (J. Virol 1991, 65, 532-6) , de Naldini et al (Science, 1996, 272, p 263-7) realizados a partir del retrovirus VIH y los de Poeschla EM et al (Nature Medecine, 1998, 4, p 354-7) realizados a partir del retrovirus VIF.

En Particular, Zufferey et al. (Nature Biotechnology (1997) 15: 871-875) describe un vector derivado de VIH-1 cuyos genes virales son delecionados y examina la influencia de diferentes construcciones del vector que aportan la secuencia que codifica la envuelta de las partículas, sobre el nivel de transducción. Zufferey et al., no discute sobre la construcción del vector de transferencia, ni divulga vectores que comprenden un polinucleótido que comprende regiones cPPT y CTS.

El documento WO97/12622 (Verma) propone un vector de transferencia (susceptible de portar un transgén) que está desprovisto de los genes retrovirales y que no comprende tampoco el polinucleótido que comprende las regiones cPPT y CTS. El documento WO97/12622 discute sobre la existencia de determinantes de la importación nuclear localizados en la proteína GAG (señal NLS) y en las proteínas VPR y gag MA

Los inventores han buscado determinantes implicados en el mecanismo de entrada del genoma retroviral en el núcleo de las células infectadas (mecanismo de importación nuclear) .

La identificación de un determinante ADN triple esencial para la importación condujo a los inventores a definir nuevos medios y, en particular, vectores utilizables para la transferencia de genes o, de forma más general, de secuencias de nucleótidos (designadas en lo sucesivo mediante la expresión “transgenes”) en células diana. Los inventores han trabajado en particular a partir del retrovirus VIH (“human immunodefficiency virus” [virus de la inmunodeficiencia humana] o HIV) , miembro de la familia de los lentivirus y han identificado y aislado un determinante viral responsable de la importación nuclear del ADN proviral de VIH en las células diana: el ADN triple central. Este ADN triple ha demostrado ser capaz de funcionar en vectores, fuera del contexto natural del genoma de VIH1, como determinante de importación nuclear que permite la entrada del genoma del vector en el núcleo de células diana.

Los mecanismos de entrada del ADN retroviral en el núcleo comprenden diferencias considerables de una familia 45 retroviral a otra. El genoma de los lentivirus es capaz de atravesar la membrana nuclear del núcleo interfásico mediante el direccionamiento y a continuación la translocación de su complejo de pre-integración (ADN lineal y proteínas asociadas) a través del poro nuclear. De este modo, estos virus son capaces de replicarse en ausencia de división de la célula diana. Estos virus infectan en particular a los macrófagos tisulares diferenciados y las células dendríticas, células en el centro de la transmisión, de la diseminación, y de la fisiopatología del VIH. Por el contrario, los genomas de los oncovirus y de los espumavirus son incapaces de atravesar la barrera que representa la membrana nuclear. Su complejo de pre-integración debe esperar a la mitosis y la desorganización de la membrana nuclear, para acceder a los cromosomas mitóticos e integrarse.

Los determinantes virales responsables de la importación nuclear del ADN del virus VIH1 han sido buscados por los inventores. La identificación y la comprensión funcional de los mecanismos moleculares de la importación nuclear 55 del complejo de pre-integración de VIH presentan, en efecto, importantes intereses fundamentales. Los inventores han identificado un mecanismo original de importación nuclear del genoma de VIH-1 según el cual esta importación estaría controlada por una estructura de ADN, una cadena triple en el centro de las moléculas de ADN lineales, generada mediante etapas particulares de la transcripción inversa lentiviral.

La estructura de ADN triple presente en el centro de las moléculas de ADN lineales generadas durante la transcripción inversa lentiviral, en particular en el retrovirus VIH, ha sido descrita por los inventores en diferentes publicaciones anteriores (Charneau P. et al., J. Mol. Biol. 1994, 241, 651-662; Chameau P. et al, Journal of Virology, mayo de 1991, p. 2415-2421; Chameau P. et al, Journal of Virology, 1992, vol. 66, p. 2814-2820.

La estructura de ADN que forma una cadena triple durante la transcripción inversa viral, es un polinucleótido que comprende una región activa en cis de iniciación central, o fragmento o “tracto” de polipurina (cPPT) , y una región activa en cis de terminación (CTS) , permitiendo estas regiones la iniciación de la transcripción de una cadena+ cuya síntesis es iniciada por la región PPT presente en el centro del genoma de VIH o de otros lentivirus, y la interrupción de la síntesis de una segunda cadena+, cuya síntesis es iniciada a nivel de un sitio PPT 3' cadena arriba de la LTR retroviral (figura 1) .

La formación de la estructura de ADN triple es la consecuencia de un suceso de desplazamiento de cadena discreto en el genoma del retrovirus, bloqueado por la secuencia CTS (Charneau et al, J. Mol. Biol., 1994) .

Se entiende que la expresión “ADN triple” utilizada en este documento designa una región de ADN de tres cadenas, sin referencia a la estructuración de estas cadenas entre sí (cadena desplazada libre, o formando una triple hélice o un bucle D... etc.) .

La estructura de ADN triple formada de este modo durante la transcripción inversa permite o, como mínimo, contribuye a la entrada del genoma retroviral en el núcleo de la célula, permitiendo debido a esto la infección de células no mitóticas.

A partir de la identificación de este mecanismo requerido para la entrada de retrovirus en el núcleo de las células diana, los inventores elaboraron una nueva generación de vector lentiviral, que incluye la región ADN triple. La introducción de un fragmento de ADN, obtenido del genoma VIH-1 y que comprende las secuencias cPPT y CTS activas en cis, en un sistema de vector VIH, aumenta la transducción de genes en las células estimulando la tasa de importación nuclear del ADN del vector. Esta generación de vectores lentivirales de cadena triple mejora notablemente la transducción de genes en células mitóticas o no.

una secuencia nucleotídica de origen retroviral o similar a retroviral, que puede prepararse de manera sintética, que comprende regiones cPPT y CTS activas en cis en la transcripción... [Seguir leyendo]

1. Vector recombinante lentiviral caracterizado por que está destinado a ser transcomplementado por las secuencias que codifican los polipéptidos GAG, POL y ENV o una parte de estos polipéptidos suficiente para permitir la formación de partículas de vector lentivirales, y por que comprende:

a) señales de regulación de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral, b) un polinucleótido derivado de un genoma lentiviral en el que es capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa, siendo dicho polinucleótido una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) , y c) una secuencia de nucleótidos de interés situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión de origen no retroviral.

2. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que comprende:

a) señales de regulación de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral, b) un polinucleótido derivado de un genoma lentiviral y obtenido mediante clonación, amplificación o síntesis y que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) , siendo estas regiones de origen lentiviral, y c) una secuencia de nucleótidos de interés situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión de origen no retroviral.

3. Vector recombinante lentiviral de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que está desprovisto de genes lentivirales.

4. Vector recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el polinucleótido que forma un ADN triple durante la transcripción inversa viral comprende una región cPPT y una región CTS activas en cis que contienen al menos 10 nucleótidos cada una.

5. Vector recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que las secuencias de origen lentiviral se derivan del virus VIH, VEAC, VAIE, VISNA, VIS o VIF.

6. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que las secuencias cPPT y CTS se derivan del genoma de un lentivirus VIH-1 o VIH-2.

7. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la secuencia de nucleótidos de interés está contenida en una casete de expresión que comprende señales reguladoras de transcripción y de expresión.

8. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el polinucleótido es una secuencia de ADN que comprende la región activa en cis de iniciación central (cPPT) y la región activa en cis de terminación (CTS) del genoma de un lentivirus VIH-1.

9. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el polinucleótido comprende las regiones cPPT y CTS de una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 14 o por que se trata de una de estas secuencias, mutada particularmente por deleción o inserción de uno o más nucleótidos, siempre que el polinucleótido permita la formación de una cadena triple durante la transcripción inversa.

10. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se trata del plásmido pTRIP.EGFP, depositado en la CNCM el 15 de abril de 1998, con el número I-2005.

11. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se trata del plásmido pTRIP.MEL-IRES-GFP, depositado en la CNCM el 20 de abril de 1999, con el número I-2185.

12. Vector recombinante caracterizado por que está destinado a ser transcomplementado por las secuencias que codifican los polipéptidos GAG, POL y ENV o una parte de estos polipéptidos suficiente para permitir la formación de partículas de vector lentivirales, y por que comprende:

a) señales de regulación de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación que tienen como origen un retrotransposón, b) un polinucleótido que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) originaria de un retrotransposón, consistiendo dicho polinucleótido en una estructura de ADN, que forma un ADN triple durante la transcripción inversa, y c) una secuencia de nucleótidos de interés.

13. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que el retrotransposón es un retrotransposón de levadura.

14. Vector recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las señales de regulación de transcripción inversa, y de encapsidación están constituidas por:

15. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que su secuencia LTR está en parte delecionada en la región U3.

16. Sistema de vectores recombinantes para la producción de partículas retrovirales que comprende: - todas o parte de las secuencias LTR retrovirales: - los sitios retrovirales PBS y PPT 3'; y - la secuencia retroviral necesaria para la encapsidación de un genoma del vector en una partícula de vector.

a) un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y b) uno o más vectores para la transcomplementación del vector recombinante mediante la aportación de secuencias que codifican los polipéptidos GAG, POL y ENV o una parte de estos polipéptidos suficiente para permitir la formación de partículas retrovirales.

17. Partículas lentivirales recombinantes cuyo genoma es una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos determinada (transgén) , situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión, y que comprende señales reguladoras de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral y un polinucleótido derivado de un genoma lentiviral, en el que es capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa, siendo dicho polinucleótido una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) , estando además dicho genoma de las partículas desprovisto de genes lentivirales.

18. Partículas lentivirales recombinantes cuyo genoma es una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos determinada (transgén) , situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión, y que comprende señales reguladoras de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral cuya secuencia LTR está en parte delecionada en la región U3 y un polinucleótido derivado de un genoma lentiviral, en el que es capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa, siendo dicho polinucleótido una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) .

19. Partículas de vector lentivirales recombinantes que comprenden:

a) un polipéptido gag correspondiente a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG) , b) un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL) , c) un polipéptido de envuelta o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV) , y d) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos determinada (transgén) situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión, una secuencia que contiene señales reguladoras de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral cuya secuencia LTR está en parte delecionada en la región U3, y un polinucleótido que es una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) , siendo estas regiones de origen lentiviral y estando insertadas en una orientación funcional con dichas señales, siendo dicho polinucleótido capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa lentiviral.

20. Partículas de vector lentivirales recombinantes que comprenden:

a) un polipéptido gag correspondiente a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG) , b) un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL) , c) un polipéptido de envuelta o polipéptidos derivados funcionales (polipéptido ENV) , y d) una secuencia nucleotídica recombinante desprovista de genes lentivirales y que comprende una secuencia de nucleótidos determinada (transgén) situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y de expresión, una secuencia que contiene señales reguladoras de transcripción inversa, de expresión y de encapsidación de origen lentiviral y un polinucleótido que es una estructura de ADN que comprende una región activa en cis de iniciación central (cPPT) y una región activa en cis de terminación (CTS) , siendo estas regiones de origen lentiviral y estando insertadas en una orientación funcional con dichas señales, siendo dicho polinucleótido capaz de adoptar una conformación de ADN triple durante la transcripción inversa lentiviral.

21. Partículas recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizadas por que los polipéptidos gag, pol y env se derivan de las secuencias de un retrovirus VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.

22. Partículas recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizadas por que los polipéptidos gag y pol se derivan de las secuencias de un retrovirus VIH y el polipéptido env se deriva de un virus diferente de VIH.

23. Partículas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, caracterizadas por que el polipéptido env es un polipéptido ENV anfótropo.

24. Partículas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, caracterizadas por que el polipéptido env es un polipéptido ENV ecótropo.

25. Partículas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, caracterizadas por que el polipéptido env se deriva del virus de la estomatitis vesicular (VEV) .

26. Células recombinantes, caracterizadas por que están recombinadas con un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o con partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25.

27. Células recombinantes de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizadas por que se trata de células eucariotas diferenciadas no mitóticas.

28. Células recombinantes de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizadas por que se trata de células mitóticas.

29. Células recombinantes de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizadas por que se trata de células eucariotas primarias o de líneas celulares inmortalizadas.

Células de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizadas por que se trata de células de pulmón, células de cerebro, células epiteliales, astrocitos, microglia, oligodendrocitos, neuronas, musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales, células madre de la médula ósea, de macrófagos, de fibroblastos, de células hematopoyéticas o de linfocitos.

31. Composición con fines terapéuticos caracterizada por que comprende un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 25 o células recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

32. Composición inmunógena caracterizada por que comprende un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 25 o células recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

33. Utilización de un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para la transfección o la transducción ex vivo de células diferenciadas no mitóticas.

34. Utilización de un vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o de partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para la transfección o la transducción ex vivo de células primarias o líneas celulares inmortalizadas.

35. Vector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o partículas de vectores recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, para la transducción in vivo con fines de terapia génica, de tejidos diferenciados no mitóticos.

36. Vector recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15 o partículas de vectores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, para la preparación de composiciones inmunógenas, de vacunación, profilácticas o terapéuticas.