Uso del gen P5{be}R2 para incrementar la síntesis de cardenólidos.

En la presente invención se describe un nuevo gen que codifica para una proteína miembro de la familia de proteínas SDR con actividad progesterona 5{be}-reductasa y específico de las especies vegetales capaces de sintetizar cardenólidos. Dicho gen, P5{be}R2, presenta una secuencia promotora capaz de incrementar la expresión del mismo en condiciones de estrés biótico, abiótico y como respuesta a diferentes elicitores químicos. El incremento en la expresión génica de P5{be}R2 se traduce en un incremento en la síntesis de cardenólidos totales por parte de las plantas que presentan dicho gen.

Uso del gen P5βR2 para incrementar la síntesis de cardenólidos.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al uso del gen P5βR2 y de la proteína que codifica, para incrementar la síntesis de cardenólidos en respuesta a situaciones de estrés biótico y abiótico. Por lo tanto, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la biología vegetal e ingeniería genética. Al ser los cardenólidos utilizados en el campo farmacéutico, la presente invención también se adscribe a este sector.

Estado de la técnica

Los cardenólidos son productos naturales obtenidos de diferentes especies del género Digitalis (Plantaginaceae). Se encuentran principalmente en forma de glicósidos. Las especies vegetales productoras de cardenólidos utilizan dichos compuestos principalmente como mecanismo de defensa frente al ataque de sus depredadores, al tratarse de sustancias tóxicas para los mismos. Así, incrementan su síntesis, principalmente en las hojas, para evitar ser devoradas por los herbívoros (Harborne J.B., 1982; Malcolm S.B. et al. 1996). En este sentido, los cardenólidos representan un interesante caso de interacción entre las plantas y el ambiente que las rodea.

Actualmente, los cardenólidos se emplean en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva y, al igual que otros productos de interés medicinal, sólo pueden ser obtenidos directamente de las plantas. Por este motivo, el estudio de los genes y enzimas implicadas en su biosíntesis son la base para el desarrollo de estrategias alternativas para su producción. En este sentido, el colesterol y diferentes fitoesteroles han sido propuestos como punto de partida para la biosíntesis de los cardenólidos, ya que la ruta bioquímica en la que participan estos productos y que da lugar a la formación de progesterona, es similar a la ruta biosintética que transforma el colesterol en hormonas esteroídicas en animales. Sin embargo, la reacción de reducción de la progesterona es un punto de intersección divergente en las rutas metabólicas de plantas y animales. La progesterona es metabolizada por reductasas estereoespecífícas de doble enlace que dan lugar a los derivados del tipo 5α o 5β. Estas reductasas son la 5α-reductasa y la 5β-reductasa. La enzima 5α-reductasa se halla estructural y funcionalmente conservada en animales y plantas. En cambio, plantas y animales han reclutado distintos genes para la codificación de las enzimas 5β-reductasas. Uno de estos genes es el P5βR, el cual es específico del reino vegetal, estando ausente en animales (Gavidia et al. 2007).

Gavidia et al. (2007) aislaron y secuenciaron un cDNA que codifica para una proteína responsable de la actividad progesterona 5β-reductasa. Mediante análisis comparativos de secuencias, demostraron que dicha enzima, P5βR, pertenece a la superfamilia de las proteínas deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR). Los motivos activos de dicha familia de proteínas se encuentran altamente conservados entre plantas y bacterias, pero mostraron que la secuencia de P5βR presenta unos motivos específicos y diferentes de los de la familia de proteínas SDR descritas hasta ahora. Se propuso que la proteína P5βR tiene un mecanismo de acción nuevo y diferente y, que además, dichas secuencias motivo definían una nueva familia de proteínas SDRs.

P5βR es una enzima presente en especies vegetales productoras de cardenólidos, así como en otras que no son capaces de sintetizarlos. Este hecho sugiere que dicha proteína debe tener otras funciones fisiológicas, aparte de la descrita como productora de cardenólidos, pudiendo existir otras enzimas más fuertemente implicadas en dicha producción y que se expresen únicamente en especies productoras de cardenólidos.

Así, en la presente invención se describe la secuencia de un nuevo gen llamado P5βR2, específico de plantas productoras de cardenólidos y cuya expresión se ve incrementada en situaciones de respuesta a estrés biótico y/o abiótico, tales como: cambios bruscos de temperatura, exceso de sales en el medio, daños de tipo mecánico y elicitores químicos. Este gen codifica para una proteína con actividad progesterona 5β-reductasa y como consecuencia de ese incremento en su expresión, se produce un incremento en la síntesis de cardenólidos. Este nuevo gen pertenece a la familia de proteínas SDR, al igual que el gen P5βR y ambos codifican para proteínas con actividad progesterona 5β-reductasa. Ambos genes presentan diferencias tanto en sus secuencias nucleotídicas (63% de homología) como en las aminoacídicas (54% de homología). Además, el gen de la presente invención no está presente en todo el reino vegetal, sino que está limitado a determinadas especies vegetales implicadas en la síntesis de cardenólidos, como por ejemplo plantas del género Digitalis (D. purpurea, D. minor, D. obscura, D. parviflora, D. dubia, D. lutea, D. lanata, etc.) e Isoplexis (I. sceptrum, I. chalcantha, I. canariensis, I. isabelliana), y de otras especies filogenéticamente relacionadas (Veronica polita y Plantago major) no productoras de cardenólidos.

La variación en la concentración de cardenólidos en especies de plantas de dichos géneros se ve afectada por condiciones de estrés biótico y/o abiótico, así como por tratamientos con agentes químicos. En este sentido, las heridas, los insectos, el CO₂, la falta o el exceso de agua, el fotoperiodo y el termoperiodo, el ácido abscísico, el etileno, el H₂O₂ y la sulfoximinabutionina (BSO) como inhibidor de la biosíntesis de glutatión, alteran la síntesis de cardenólidos, normalmente incrementando su producción. En la presente invención se demuestra que el incremento en la expresión del gen P5βR2 tiene como consecuencia un incremento en la síntesis de cardenólidos. Por este motivo se piensa que el gen de la presente invención, P5βR2, tiene una implicación directa en la síntesis de cardenólidos, al contrario del gen P5βR, que tendría otras funciones fisiológicas diferentes de las derivadas de la síntesis de cardenólidos, al expresarse ubicuamente en todo el reino vegetal, no como P5βR2 que es exclusivo de especies productoras de cardenólidos y de algunas relacionadas filogenéticamente. En este sentido, la presente invención demuestra que diferentes condiciones de estrés y determinadas sustancias químicas como las arriba mencionadas, son capaces de inducir un incremento en la expresión génica de P5βR2 y como consecuencia se produce un incremento en la síntesis de cardenólidos. Por el contrario, esos mismos factores, no inducen un aumento ni modifican la expresión génica basal del gen P5βR.

En el metabolismo secundario, existen muchos casos de familias multigénicas que codifican diferentes proteínas con similares propiedades bioquímicas y que se diferencian exclusivamente en su inducción y/o distribución, en un tejido o en un órgano específico. En el caso de la presente invención se demuestra que la enzima P5βR2 presenta similar función, actividad progesterona 5β-reductasa, que la enzima P5βR, pero la expresión de su gen es inducible en diferentes condiciones, como por ejemplo, temperaturas altas y bajas, alta concentración de sales en el suelo, daños de tipo mecánico, tratamiento con ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) y agua oxigenada (H₂O₂), mientras que la expresión del gen P5βR no se ve modificada.

Descripción de la invención

Los cardenólidos son productos naturales que se encuentran principalmente en forma de glicósidos y son obtenidos de diferentes especies del género Digitalis (Plantaginaceae). Estos compuestos son una droga inotrópica preferentemente de administración oral y muy segura en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva.

La presente invención describe el uso de un nuevo gen llamado P5βR2 para producir un incremento en la síntesis de cardenólidos en plantas capaces de sintetizarlos, como respuesta a diferentes tratamientos con elicitores o a condiciones de estrés. P5βR2 codifica una proteína perteneciente a la superfamilia de proteínas SDR, con actividad progesterona 5β-reductasa. La secuencia de P5βR2 presenta una homología del 63% respecto a la secuencia del... [Seguir leyendo]

1. Secuencia nucleotídica aislada de plantas representada por SEQ ID NO:4 que codifica para una proteína, representada por SEQ ID NO:5, con actividad progesterona 5β-reductasa, capaz de incrementar la síntesis de cardenólidos en plantas como respuesta a condiciones de estrés de tipo biótico, abiótico y/o tratamiento con elicitores químicos.

2. Secuencia según la reivindicación 1 caracterizada porque la planta se selecciona entre los géneros Digitalis, preferentemente D. purpurea, D. grandiflora, D. davisiana, D. ferruginea, D. ciliata, D. viridiflora, D. laevigata, D. minor, D, obscura, D. parviflora, D. dubia, D. lutea, D. lanata, e Isoplexis, preferentemente, I. sceptrum, I. chalcan- tha, I. canariensis, I. isabelliana, y otras especies filogenéticamente relacionadas, preferentemente Veronica polita y Plantago major.

3. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizada porque las condiciones de estrés abiótico se seleccionan entre: altas temperaturas, preferentemente por encima de 40ºC; bajas temperaturas, preferentemente por debajo de 4ºC; alta salinidad en el medio, preferentemente por encima de 250 mM de NaCl.

4. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizada porque las condiciones de estrés biótico son de tipo mecánico, preferentemente en forma de heridas o cortes en la planta.

5. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizada porque los elicitores químicos se seleccionan entre: etileno y especies reactivas de oxígeno, preferentemente H₂O₂.

6. Vector de expresión que comprende y expresa la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO:4.

7. Célula no humana transformada con el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Célula según la reivindicación 7 caracterizada por ser la cepa de E. coli CECT 7463.

9. Uso de las células de las reivindicaciones 7 u 8 para la producción de proteína recombinante con actividad progesterona 5β-reductasa.

10. Uso según la reivindicación 9 en que la proteína recombinante obtenida está representada por SEQ ID NO:5.

11. Uso de la secuencia nucleotídica de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de proteína recombinante con actividad progesterona 5β-reductasa.

12. Uso según la reivindicación 11 en que la proteína recombinante obtenida está representada por SEQ ID NO:5.

13. Uso de la secuencia nucleotídica de las reivindicaciones 1 a 6 para producir cardenólidos.

14. Uso según la reivindicación 13 en que los cardenólidos se producen en plantas, preferentemente de los géneros Digitalis e Isoplexis.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 en que las plantas son sometidas a estrés biótico o abiótico y/o tratamiento con elicitores químicos.