El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ.

ID. No.: 181 para reducir o silenciar laexpresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabacoelaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma.

Uso de un gen para el citocromo p450 de Nicotiana

La presente invención se relaciona en general con secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas de citocromo p450 (en lo sucesivo denominadas como enzimas p450 y p450) en plantas de Nicotiana y con métodos para la utilización de dichas secuencias de ácido nucleico para alterar fenotipos de las plantas.

Antecedentes

Los citocromos p450 catalizan las reacciones enzimáticas para una amplia gama de sustratos químicamente diferentes que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductivo de sustratos endógenos y xenobióticos. En las plantas, los p450 participan en las rutas bioquímicas que incluyen la síntesis de productos vegetales, tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glucósidos cianogénicos y glucosinolatos (Chappel, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 198, 49: 311 - 343) . Los citocromos p450, también conocidos como proteínas hemotiolato p450, por lo general actúan como oxidasas terminales en las cadenas de transferencia de electrones de múltiples componentes, llamados sistemas monooxigenasa que contienen p450. Las reacciones específicas catalizadas incluyen desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfoxidación, N, S, y Odesalquilaciones, desulfatación, desaminación, y reducción de grupos azo, nitro y N-óxido.

El papel diverso de las enzimas p450 de la planta Nicotiana ha sido implicado en la elaboración de una variedad de metabolitos de plantas tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glucósidos cianogénicos, glucosinolatos y una gran cantidad de otras entidades químicas. Durante los últimos años, se ha hecho evidente que algunas enzimas p450 puede afectar a la composición de metabolitos vegetales en las plantas. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y el aroma de ciertas plantas mediante la alteración de su perfil de ácidos grasos seleccionados a través de fitomejoramiento; sin embargo, se conoce muy poco acerca de los mecanismos implicados en el control de los niveles de estos constituyentes de la hoja. La reducción de la expresión de las enzimas p450 asociadas con la modificación de ácidos grasos puede facilitar la acumulación de ácidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotípicas de la hoja más preferida. Se siguen descubriendo la función de las enzimas p450 y su ampliación de funciones en los constituyentes de las plantas. Por ejemplo, se encontró que una clase especial de enzimas p450 catalizan la degradación de ácidos grasos en alcoholes y aldehídos C6 y C9 que son los principales contribuyentes del olor "verde fresco" de frutas y verduras. El nivel de otras nuevas p450 objetivo puede ser alterado para mejorar las cualidades de los componentes de la hoja mediante la modificación de la composición lipídica y de los metabolitos degradados relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la hoja se ven afectados por la senectud, que estimula la maduración de las propiedades de calidad de la hoja. Incluso otros reportes han mostrado que las enzimas p450 juegan un papel funcional en la alteración de los ácidos grasos que están involucrados en las interacciones planta-patógeno y en la resistencia a las enfermedades.

En otros casos, se ha sugerido que las enzimas p450 están involucradas en la biosíntesis de alcaloides. La nornicotina es un alcaloide menor que se encuentra en Nicotiana tabaceum. Se ha postulado que es producido por la desmetilación mediada por p450 de la nicotina seguido por acilación y nitrosación en la posición N produciendo con ello una serie de N-acilnonicotinas y N-nitrosonornicotinas. La N-desmetilación, catalizada por una desmetilasa p450 putativa, se piensa que es una fuente primaria de la biosíntesis de nornicotina en Nicotiana. Aunque se cree que la enzima es microsomal, hasta ahora no se ha purificado con éxito una enzima nicotina desmetilasa, ni se han aislado los genes involucrados.

Además, se ha formulado la hipótesis pero no se ha comprobado, que la actividad de las enzimas p450 está controlada genéticamente y también fuertemente influenciada por factores ambientales. Por ejemplo, la desmetilación de la nicotina en Nicotiana se cree que incrementa considerablemente cuando las plantas alcanzan una etapa de madurez. Además, se ha formulado la hipótesis aún no demostrada que el gen para la desmetilasa contiene un elemento transponible que puede inhibir la traducción del ARN cuando está presente.

La gran multiplicidad de formas de la enzima p450, sus diferentes estructuras y funciones han hecho que las investigaciones sobre las enzimas p450 de Nicotiana sean muy difíciles antes de la presente invención. Además, la clonación de enzimas p450 se ha visto obstaculizada al menos en parte debido a que estas proteínas localizadas en la membrana están típicamente presentes en baja cantidad y con frecuencia son inestables para la purificación. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar las enzimas p450 en las plantas y las secuencias de ácido nucleico que están relacionadas con esas enzimas p450. En particular, sólo unas pocas proteínas del citocromo p450 han sido reportadas en Nicotiana. La presente divulgación implica el descubrimiento de un número sustancial de fragmentos de citocromo p450 que corresponden a diferentes grupos de especies de p450 con base en su identidad de secuencia.

En un primer aspecto, la presente invención está dirigida al uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 para reducir o silenciar la expresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabaco elaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma, como se define en las reivindicaciones.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para generar una planta transgénica de Nicotiana que tiene una expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa, como se define en las reivindicaciones.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con un método para reducir o silenciar la expresión de nicotina desmetilasa en una planta de Nicotiana, como se define en las reivindicaciones.

Finalmente, la invención se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 181 para identificar y seleccionar plantas de Nicotiana que tienen expresión alterada de nicotina desmetilasa, como se define en las reivindicaciones.

Las plantas resultantes transformadas se evalúan con respecto a los cambios fenotípicos incluyendo, pero sin limitarse a, análisis de transcripciones de ARN endógeno para p450, péptidos expresados de p450, y concentraciones de metabolitos de la planta utilizando técnicas que se encuentran comúnmente disponibles para alguien normalmente capacitado en el arte.

En un décimo aspecto importante, la presente invención está dirigida también a la generación de líneas transgénicas de Nicotiana que tienen niveles alterados de actividad de la enzima p450. De acuerdo con la invención, estas líneas transgénicas incluyen una secuencia de ácido nucleico que es efectiva para reducir o silenciar o incrementar la expresión de nicotina desmetilasa resultando así en efectos fenotípicos en Nicotiana. La secuencia de ácido nucleico es SEQ. ID. NOS.

En un onceavo aspecto muy importante de la divulgación, las variedades cultivadas de la planta incluyen ácidos nucleicos de la presente divulgación en una capacidad reducida utilizando ya sea genes completos o fragmentos de los mismos o en una capacidad de sobreexpresión utilizando genes completos que tendrán perfiles alterados de metabolitos con relación a las plantas de control.

Se provee también un producto de tabaco que incluye hoja de tabaco (lámina y/o tallo) que tiene cantidades reducidas de nornicotina. El producto de tabaco incluye tabaco (hoja de tabaco incluyendo lámina y/o tallo) de una planta que incluye las secuencias descritas aquí o en donde los genes que codifican nitrosaminas específicas del tabaco han sido eliminados o suprimidos. La eliminación o supresión de genes que codifican nitrosaminas específicas del tabaco es efectiva para reducir las nitrosaminas específicas del tabaco en los productos de tabaco aproximadamente del 5 hasta aproximadamente el 10%, en otro aspecto aproximadamente del 10 al 20%, en otro aspecto aproximadamente del 20 al 30%, y en otro aspecto más del 30%, en comparación con los productos del tabaco elaborados a... [Seguir leyendo]

1. El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 para reducir o silenciar la expresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabaco elaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación antisentido.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación sentido.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula de ácido nucleico se expresa como una molécula de ARN bicatenario.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el producto de tabaco se selecciona del grupo que consiste de cigarrillos, cigarros, tabaco de pipa, tabaco en polvo, tabaco para mascar, productos mezclados con el producto de tabaco, y sus mezclas.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tejido es una hoja que incluye lámina y / o tallo.

7. Un método para generar una planta transgénica de Nicotiana que tiene una expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa, que comprende las etapas de:

(i) enlazar operativamente una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 con un promotor funcional en la planta de Nicotiana para crear un vector de transformación de la planta;

(ii) transformar la planta de Nicotiana con el vector de transformación de la planta de la etapa (i) ;

(iii) seleccionar una célula de la planta transformada con el vector de transformación;

(iv) regenerar una planta transgénica de Nicotiana de la célula de la planta transformada; y

(v) seleccionar una planta transgénica de Nicotiana que tiene expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa.

8. Un método para reducir o silenciar la expresión de nicotina desmetilasa en una planta de Nicotiana, que comprende las etapas de:

(i) enlazar operativamente una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 con un promotor funcional en la planta de Nicotiana para crear un vector de transformación de la planta;

(ii) transformar la planta de Nicotiana con el vector de transformación de la planta de la etapa (i) ;

(iii) seleccionar una célula de la planta transformada con el vector de transformación;

(iv) regenerar una planta transgénica de Nicotiana de la célula de la planta transformada; y

(v) seleccionar una planta transgénica de Nicotiana que tiene expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación antisentido.

10. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación sentido.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la molécula de ácido nucleico se expresa como una molécula de ARN bicatenario.

12. El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 181 para identificar y seleccionar plantas de Nicotiana que tienen expresión alterada de nicotina desmetilasa.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de hibridar, bajo condiciones rigurosas, materiales de ácido nucleico de la planta a partir de plantas Nicotiana con una sonda de ácido nucleico que hibrida a la SEQ ID NO:181 bajo condiciones que incluyen un lavado en SSC 0, 2X a una temperatura de 65°C.

14. El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de llevar a cabo una PCR sobre material de ácido nucleico de la plantas de Nicotiana por la presencia de un gen de longitud completa que hibrida

15. El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de hibridar materiales de ácido nucleico de la planta a partir de plantas de Nicotiana con un arreglo de oligonucleótidos de alta densidad, dicho

arreglo comprendiendo sondas de oligonucleótido que tienen secuencias de nucleótidos a partir de un gen de longitud completa que hibrida a la SEQ ID NO: 181 bajo condiciones rigurosas que incluyen un lavado en SSC 0, 2X a una temperatura de 65°C.

16. El uso de cualquiera de las reivindicacione.

13. 15, en donde dicha hibridación de ácido nucleico es una hibridación de transferencias tipo Southern.

17. El uso de cualquiera de las reivindicacione.

13. 15, en donde dicha hibridación de ácido nucleico es una hibridación de transferencias tipo Northern.

18. El uso de cualquiera de las reivindicacione.

12. 17, en donde dichas plantas de Nicotiana comprende una o más plantas convertidoras o no convertidoras.

19. El uso de cualquiera de las reivindicacione.

12. 18, que comprende además la etapa de seleccionar dicha al 15 menos una planta identificada como parte de un programa de fitomejoramiento o un programa de mutagénesis.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde dicho programa de fitomejoramiento comprende el uso de una variedad tradicional o una variedad transgénica.

21. El uso de cualquiera de las reivindicacione.

12. 20, en donde dichas plantas comprenden una pluralidad de plantas de Nicotiana tabacum.

FIG. 75

NOMBRE D89-AB1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 149

SEQ. ID. NO. 150

NOMBRE D95-AG1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 155 NOMBRE D96-AB6 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 157

SEQ. ID. NO. 170

NOMBRE D110-AF12 (166, 1631) ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 175

NOMBRE D112-AA5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 177

NOMBRE D163-AF12 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 195 NOMBRE D163-AG11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 197

SEQ. ID. NO. 208

ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ. ID. NO. 215

NOMBRE D208-AC8 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 217

NOMBRE D222-BH4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 235 NOMBRE D224-AF10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 237

NOMBRE D249-AE8 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 255 NOMBRE D250-AC11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 257

SEQ. ID. NO. 258

NOMBRE D205-BE9 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 275 NOMBRE D136-AF4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 277

SEQ. ID. NO. 282

NOMBRE D267-AF10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 295 NOMBRE D284-AH5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 297

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 1

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 2

PORCENTAJE DE IDENTIDAD GRUPO 2

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 3

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 4

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 4

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 5

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 6

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 7

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 7

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 9

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 9

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 14

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 14

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 15

FIGURA 151: COMPARACIÓN DE GRUPOS DE SEQUENCIA

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 15

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 16

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 16

10 ALINEAMIENTO DEL GRUPO 17

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 18

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 18

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 19

10 PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 19

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 20

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 22

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 22

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 25

ALINEAMIENTO DEL GRUPO 28

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 28

PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 30

Figura 153: Clonación de Fragmentos de ADNc para Citocromo p450 por medio de PCR