UNIDADES DE EXPRESIÓN DE P-EF-TS EN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM.

Método para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor,

que contiene

A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o

B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o

C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas, en cuyo caso los genes respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor son heterólogos.

Unidades de expresión de P-EF-TS en CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

La presente invención se refiere a un método para modificar o causar la rata de transcripción de genes y a microorganismos genéticamente modificados con rata de transcripción modificada o causada.

Varios productos biosintéticos, como por ejemplo compuestos de química fina tales como, entre otros, aminoácidos, vitaminas, pero también proteínas, se producen mediante procesos metabólicos naturales en células y se usan en muchas ramas de la industria, incluida la industria de productos alimentos, de forrajes y comida para animales, de cosméticos, de piensos y alimentos para humanos y animales, y la industria farmacéutica. Estas sustancias, que se denominan conjuntamente como productos de química fina / proteínas, comprenden, entre otras, ácidos grasos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como proteínas y enzimas. Su producción se efectúa de la manera más conveniente a gran escala mediante el cultivo de bacterias que se desarrollaron con el fin de producir y secretar grandes cantidades de la sustancia respectivamente deseada. Para este propósito los organismos particularmente adecuados son bacterias corineformes, bacterias gram-positivas no patógenas.

Se conoce que los aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes, principalmente Cor y nebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia, permanentemente se trabaja en el mejoramiento de los procesos de producción. Los mejoramientos de proceso pueden concernir medidas de fermentación industrial como, por ejemplo, agitación y abastecimiento de oxígeno, o la composición de medios nutrientes como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación o el procesamiento para obtener el producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico pero también secamiento por pulverización o la propiedades de desempeño intrínsecas del mismo microorganismo.

Desde hace unos años se emplean igualmente métodos de la ingeniería genética de ADN recombinante para el mejoramiento de la cepas que producen productos de química fina / proteínas de la bacteria Cor y nebacterium, amplificando genes individuales e investigando el efecto sobre la producción de productos de química fina/proteínas.

Otros modos para desarrollar un proceso para la producción de productos de química fina, aminoácidos o proteínas, o para elevar o para mejorar la productividad de un proceso ya existente para la producción de productos de la química fina, aminoácidos o proteínas son elevar o modificar la expresión de uno o varios genes o influir la traducción de un ARNm mediante secuencias adecuadas de polinucleótidos. La influencia en este contexto puede ser la elevación, la disminución o también otros parámetros de la expresión de genes como patrones temporales de expresión.

El experto en la materia conoce los diferentes componentes de las secuencias bacteriana de regulación. Se distinguen los sitios de enlace de reguladores, llamados también operadores, los sitios de enlace de holoenzimas - polimerasa - ARN, llamados también regiones 35 y 10 y el sitio de enlace de ARN -16S ribosómico, llamado también sitios de enlace ribosómicos o secuencia Shine-Dalgarno.

Como secuencia de sitio de enlace ribosómico, también llamado secuencia de Shine-Dalgarno, en el sentido de esta invención se entienden secuencias de polinucleótidos que se anteponen hasta 20 bases antes del inicio del codón de la traducción.

En la bibliografía (E. coli y S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press) se describe que tanto la composición de la secuencia de polinucleótido de la secuencia Shine-Delgarno, la sucesión de secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótido contenida en la secuencia Shine-Delgarno tiene una influencia esencial en la rata de iniciación de la traducción.

Las secuencias de ácido nucleico con actividad de promotor pueden influir en la formación de ARNm de diferente manera. Los promotores cuya actividad es independiente de la fase de crecimiento fisiológica del organismo se llaman constitutivos. A su vez, otros promotores reaccionan a estímulos químicos y físicos externos como oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. A su vez otros muestran una fuerte dependencia de su actividad en diferentes fases de desarrollo. A manera de ejemplo, en la bibliografía se describen promotores que durante la fase de crecimiento exponencial de los microorganismos muestran una actividad particularmente pronunciada, pero también exactamente en la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia favorable en la productividad para una producción de productos de química fina y proteínas según la vía metabólica.

Por ejemplo, pueden aprovecharse promotores que desconectan la expresión de un gen durante el crecimiento, pero que la conectan después de un crecimiento óptimo con el fin de regular un gen que controla la producción de un metabolito. La cepa modificada tiene luego los mismos parámetros de crecimiento que la cepa de partida, pero produce más producto por célula. Este tipo de modificación puede aumentar tanto el título (g de producto/litro) como también el rendimiento de C (g de producto/g de fuente de C) .

En especies de Cor y nebacterium ya han podido aislarse aquellas secuencias de nucleótido que pueden utilizarse para un aumento o un debilitamiento de la expresión génica. Estos promotores regulados pueden reducir la rata con la que se transcribe un gen dependiendo de las condiciones internas y/o externas de la célula. La presencia de un factor determinado, conocido como inductor, puede estimular en parte la rata de la transcripción del promotor. Los inductores pueden afectar directa o indirectamente la transcripción del promotor. Otra clase de factores, conocidos como supresores, está en capacidad de reducir o de inhibir la transcripción del promotor. Tal como los inductores, también los supresores pueden actuar directa o indirectamente. Sin embargo, también se conocen promotores que se regulan por la temperatura. De esta manera, el nivel de transcripción de tales promotores puede aumentarse, o si no debilitarse, por ejemplo elevando la temperatura de crecimiento o mediante la temperatura de crecimiento normal de las células.

Hasta hoy se ha descrito una pequeña cantidad de promotores de C. glutamicum. El promotor del gen de malato sintasa de C. glutamicum se describió en DE 4440118. Este promotor se antepuso a un gen estructural que codifica para una proteína. Después de la transformación de tal constructo en una bacteria corineforme se regula la expresión del gen estructural insertado después del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto al medio se adiciona un inductor correspondiente.

Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) han descrito una fusión de transcripción entre el promotor pta-ack de C. glutamicum y un gen reportero (cloranfenicol acetiltransferasa) . Las células de C. glutamicum que tienen una tal fusión de transcripción presentaron una expresión elevada del gen reportero durante el crecimiento en medio que contenía acetato. En comparación con esto, las células transformadas que crecieron en glucosa no mostraron una expresión aumentada de este gen reportero.

En Pa'tek et al., Microbiology 142:1297 (1996) se describieron algunas secuencias de ADN de C. glutamicum que pueden fortalecer la expresión de un gen reportero en células de C. glutamicum. Estas secuencias se compararon entre sí para definir secuencias de consenso para promotores de C. glutamicum.

Otras secuencias de ADN de C. glutamicum que pueden utilizarse para la regulación de la expresión de gen se han descrito en la patente WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados representan unidades de expresión de Cor y nebakterium glutamicum que pueden utilizarse o bien para aumentar o sino para disminuir una expresión de gen. Además, en esta patente se describen plásmidos recombinantes sobre los que se asocian unidades de expresión de Cor y nebakterium glutamicum con genes heterólogos. El método descrito aquí, la fusión de un promotor de Cor y nebacterium glutamicum con un gen heterólogo, puede emplearse entre otras para la regulación de los genes de la biosíntesis de aminoácido.

El objetivo fundamental... [Seguir leyendo]

1. Método para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor, que contiene A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas, en cuyo caso los genes respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor son heterólogos.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por los ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra b1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios de los ácidos nucleicos a transcribir.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque para aumentar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre se regula la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra

bh1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor incrementada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o bh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica o bh3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden obtener opcionalmente otros elementos de regulación.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartato-quinasa, aspartato-semialdehído-dehidrogenasa, diaminopimelatodehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvato-carboxilasa, triosa-fosfato isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LisR1, regulador de transcripción LisR2, malato-quinonaoxireductasa, glucosa-6-Ffosfato-dehidrogenasa, 6-fosfogluconato-dehidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metileno-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserinafosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserina-dehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, exportador - soporte de treonina, treonina-dehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginiloARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinhidroximetiltransferasa, fructosa1, 6-bifosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.

7. Microorganismo genéticamente modificado en el cual la modificación genética conduce a modificar o a causar la rata de transcripción de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre y depende de la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor que contienen

A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.

8. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra b1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico, que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.

9. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7 u 8 con rata de transcripción elevada o causada de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre, caracterizado porque la transcripción de genes en el microorganismo se regula por ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.

10. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 9, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por los ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra

bh1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor aumentada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor, o bh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, o bh3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.

11. Microorganismo genéticamente modificado según una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de los ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo cado los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.

12. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 11, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartatoquinasa, aspartato-semialdehídodehidrogenasa, diaminopimelato-dehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvatocarboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LisR1, regulador de transcripción LisR2, malato-quinona-oxireductasa, glucosa-6-fosfato-dehidrogenasa, 6-fosfogluconatodehidrogenasa, transquetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahioningamma-sintasa, cistahionin-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolatoreductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, exportador - soporte de treonina, treonina-dehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionin-sintasa dependiente de coenzima B12, metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginilo-ARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinhidroximetiltransferasa, fructosa-1, 6-bifosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.