Un ADN aislado que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1.

Un fragmento aislado de adn del promotor humano de sparc y su uso

Area de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de la terapia génica. En particular la presente invención se refiere a una secuencia de ADN, aislada, con actividad promotora, capaz de dirigir la expresión de un gen de interés, particularmente en una célula tumoral. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores que contienen un fragmento de ADN aislado del promotor de SPARC asociado a un gen de interés, a composiciones farmacéuticas y su uso en terapia del cáncer.

Antecedentes de la invención

La proteína SPARC (del inglés secreted protein, acidic and cystein-rich, es decir, proteína secretada, ácida y rica en cisteína, ) también conocida como osteonectina o como BM40, es una glicoproteína secretada, ampliamente distribuida en tejidos humanos y no humanos, cuyas funciones y efectos son amplios y diversos. Se ha encontrado que interactúa con componentes de la matriz extracelular, con factores de crecimiento, con citoquinas y con la expresión de metaloproteinasas de matriz.

La proteína SPARC ha sido inicialmente descripta por Ledda, M.F. y col (Ledda, M.F., Adris, S., Bravo, A.I., Kairiyama, C., Bover, L., Chernajovsky, Y., Mordoh, J., y Podhajcer, O.L., Suppression of SPARC expression by antisense RNA abrogates the tumorigenicity of human melanoma cells. Nat Med, 3: 171-176, 1997) como poseedora de un rol central en la malignidad del melanoma humano. Estudios posteriores demostraron que la sobreexpresión de SPARC está asociada a la progresión maligna de diversos tipos de tumores (Porte, H., Triboulet, J.P., Kotelevets, L., Carrat, F., Prevot, S., Nordlinger, B., DiGioia, Y., Wurtz, A., Comoglio, P., Gespach, C., y Chastre, E. Overexpression of stromelysin-3, BM-40/SPARC, and MET genes in human esophageal carcinoma: implications for prognosis. Clin Cancer Res, 4: 1375-1382, 1998) . La proteína SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en endotelio como en fibroblastos activados de tumores in vivo (Lane, T.F. y Sage, E.H. The biology of SPARC, a protein that modulates cell-matrix interactions. Faseb J, 8: 163-173, 1994) .

Los promotores de SPARC humano (Hafner, M., Zimmermann, K., Pottgiesser, J., Krieg, T., y Nischt, R.

A purine-rich sequence in the human BM-40 gene promoter region is a prerequisite for maximum transcription. Matrix Biol, 14: 733-741, 1995) , promotores de SPARC murino (McVey, J.H., Nomura, S., Kelly, P., Mason, I.J., y Hogan, B.L. Characterization of the mouse SPARC/osteonectin gene. Intron/exon organization and an unusual promoter region. J Biol Chem, 263: 11111-11116, 1988) y promotores de SPARC bovino (Young, M. F., Findlay, D. M., Dominguez, P., Burbelo, P. D., McQuillan, C., Kopp, J. B., Robey, P. G., and Termine, J. D. Osteonectin promoter. DNA sequence analysis and S1 endonuclease site potentially associated with transcriptional control in bone cells. J Biol Chem, 264: 450-456, 1989) han sido clonados y caracterizados. La comparación entre estos promotores muestra que, al igual a lo observado a nivel del gen, existe una alta homología de secuencia.

En la Figura 1 se muestra la estructura del promotor SPARC humano, donde se esquematizan el primer exón, las cajas GGA1 y GGA2, la región Inter-GGA de 10 nucleótidos que las separa y la secuencia TATA no consenso. El promotor de SPARC humano carece de una caja TATA consenso (Breathnach, R. y col., Organization and expression of eucar y otic split genes coding for proteins, Annu Rev Biochem, 50: 349-383, 1981) pero contiene un elemento denominado TATA-like dado que comparte algunas bases con la secuencia convencional. El promotor contiene dos cajas GGA1 y GGA2, de las cuales la caja GGA1 exhibe una gran similitud entre las especies humana y bovina.

Hafner y colaboradores observaron que la caja GGA1 es necesaria y suficiente para obtener una máxima actividad transcripcional, mientras que el elemento espaciador que separa las dos cajas GGA posee un efecto negativo sobre su expresión (Hafner M. y col., 1995) . Es importante destacar que este grupo ha demostrado que en humanos la región promotora que contiene sólo las cajas GGA no es suficiente por sí sola para conferir especificidad de expresión en diferentes líneas celulares. Domínguez y colaboradores describieron la región comprendida entre las bases -504 a +11 del promotor bovino como un elemento positivo para la transcripción de SPARC en células fetales bovinas. Este fragmento también confiere expresión específica, mostrando mayor actividad en células con mayor nivel de expresión de ARNm de SPARC (Dominguez, P., Ibaraki, K., Robey, P.G., Hefferan, T.E., Termine, J.D., y Young, M.F. Expression of the osteonectin gene potentially controlled by multiple cis- and trans-acting factors in cultured bone cells. J Bone Miner Res, 6: 11271136, 1991) . Observaron también que sólo las cajas GC (también llamado GC box, que es un elemento común de muchas regiones promotoras; su secuencia consenso es GGGCGG. Puede estar presente en más de una copia.

Se localiza entre los -40 a -100 pb) y GGA1 no son suficientes para la máxima expresión de SPARC en células de hueso bovinas, y que la región localizada entre las bases -927 a -504 produce una dramática inhibición de la transcripción.

La terapia génica representa potencialmente uno de los más importantes desarrollos que están teniendo lugar en medicina. A fin de modificar un tipo de célula o tejido específicos, los genes terapéuticos deben ser suministrados eficientemente a la célula de modo que el gen se exprese en el nivel apropiado y durante una suficiente duración de tiempo. Dos tipos de estrategias se están aplicando para el suministro de ADN a células, esto es mediante vectores virales y no-virales. Si bien se ha desarrollado un gran número de virus destinados a la transferencia de genes, el mayor interés se ha centrado en retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus de herpes simplex tipo 1. Los adenovirus de primera generación son defectivos en la proteína E1A, por lo tanto no se replican. La proteína temprana E1A es la primera proteína que produce el ADN viral dentro de la célula. E1A tiene muchas funciones como la de ayudar a que se produzcan las demás proteínas virales y estimular el crecimiento celular (se une y suprime un inhibidor del crecimiento celular p53) , facilitando la transcripción y replicación viral. Si bien aquellos adenovirus defectivos en la proteína E1A fueron utilizados con éxito como vectores en modelos preclínicos de cáncer, no se lograron los mismos resultados cuando fueron utilizados en ensayos clínicos, siendo uno de los mayores problemas su baja capacidad de transducción in vivo (Vile, R. Cancer gene therapy-new approaches to tumour cell killing. J Gene Med, 2: 141-143, 2000) .

Una de las formas de superar este obstáculo ha sido mediante la creación de una nueva generación de vectores capaces de replicarse en forma condicional en el ambiente tumoral; a estos vectores se los denomina CRAds u oncolíticos (del inglés Conditionally Replicative Adenovirus u oncolytic adenoviruses, es decir adenovirus oncolíticos de replicación condicionada) . Los CRAds se construyen modificando el genoma adenoviral de tal forma de regular la expresión de la proteína E1A con un promotor que resulte específicamente activo en el tejido o tipo celular requerido, de modo de evitar el daño de los tejidos vecinos.

En los últimos años distintos grupos de investigación se han dedicado al armado de adenovirus recombinantes. De esta manera algunos de los genes virales que fueron eliminados en un pasado son reinsertados nuevamente dado que mejoran la replicación viral. Tal es el caso de la región E3. E3 es un fragmento de ADN del virus que codifica para 9 proteínas cuya función principal es la de inhibir la muerte celular inducida por la respuesta inmune del huésped. Entre las 9 proteínas se destaca la ADP (Adenoviral Death Protein) que tiene una función contradictoria a sus compañeras E3 porque promueve la lisis celular tardía en el ciclo de infección viral para permitir la liberación de los viriones maduros al microambiente celular. Se ha visto que las células que fueron infectadas con un adenovirus que no expresa ADP permanecen mucho más tiempo viables que las células infectadas con el adenovirus wild type (Tollefson, A.E. y col. The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants, Virology, 220: 152-162, 1996; Tollefson, A.E y col., The adenovirus death protein... [Seguir leyendo]

1. Un ADN aislado que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1.

2. El ADN aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia promotora está operablemente ligada a un gen heterólogo.

3. El ADN aislado de la reivindicación 1, que además comprende un segundo promotor de ácido nucleico.

4. El ADN aislado de la reivindicación 3, que además comprende una secuencia reguladora seleccionada de una secuencia de respuesta a radiación, una secuencia de respuesta a hipoxia o una secuencia de respuesta a radicales libres.

5. El ADN aislado de la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo es un gen terapéutico.

6. El ADN aislado de la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo está seleccionado a partir del grupo que consiste de: un gen de E1A, un gen suicida, la región E3 del genoma adenoviral y un gen que codifica una interleuquina.

7. Un vector de expresión que comprende el ADN aislado de la reivindicación 1 y un gen heterólogo operablemente ligado al mismo.

8. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el vector es un plásmido o un vector viral.

9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en donde el vector viral es un adenovirus recombinante.

10. El vector de expresión de la reivindicación 8, en donde el vector viral es un Adenovirus Oncolítico de Replicación Condicionada.

11. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el gen heterólogo es un gen terapéutico.

12. El vector de expresión de la reivindicación 11, en donde el gen heterólogo es un gen de la proteína E1A.

13. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el gen heterólogo es un gen suicida.

14. El vector de expresión de la reivindicación 13, en donde el gen suicida es el gen de timidina quinasa de un virus de herpes (hsvTK) .

15. El vector de expresión de la reivindicación 7, que además comprende una región E3 del genoma adenoviral.

16. Un método ex-vivo para expresar ADN foráneo en una célula huésped, comprendiendo el método introducir dentro de la célula huésped el vector de expresión de la reivindicación 7.

17. Una composición farmacéutica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7 en un portador farmacéuticamente adecuado.

18. El uso de una composición farmacéutica de la reivindicación 17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un paciente que sufre del mismo.

19. Un vector de expresión que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1 de acuerdo a la reivindicación 1.

Exon 1

Inter-GGA

+1 +70

GGA GGA

TATA-like INR1 INR2

box 2 box 1

- 12/-7 -1/+6 +18/+24

FIG. 1

Expresión relativa de ARNm de SPARC

Líneas celulares FIG. 2

Exon 1

- 12/-7 -1/+6 +18/+24 +29/+33

FIG. 3

Inducción con respecto a pGL3-Basic Inducción con respecto a pGL3-Basic

550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

- 1175/+71

A375N

- 1175/+35

MeL-Les

- 1175/+28

Mel888

- 513/+71

MelJ

- 513/+35

FIG. 4 A

Spdel F512

SB2

- 513/+28

T84

- 513/+24

- 120/+71-120/+35-120/+28SpdelpGL3 prompGL3-Basic

LoVoBAECWI-38 VAU87HeLa

T-47D

FIG. 4 B

67 68 69

72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Literatura diferente de patentes citada en la descripción 82 83