Transgenes de supresión de genes dominantes y métodos para usar los mismos.

Un método para controlar la expresión de una variante alélica de un gen de interés en una planta o célula de planta,

que comprende:

(a) silenciar dicho gen de interés usando una construcción pIR dirigida al promotor que dirige la expresión de dicho gende interés; y

(b) expresar recombinantemente dicha variante alélica unida operativamente a un segundo promotor.

Transgenes de supresión de genes dominantes y métodos para usar los mismos Campo de la invención La invención se refiere al control de la expresión de una variante alélica de un gen de interés en una planta o célula de planta.

Antecedentes de la invención WO 2005/059121 describe composiciones y métodos para la supresión de genes dominantes. Cigan et al. (2005) Plant Journal 43: 929-940 describe el silenciamiento transcripcional de genes como una herramienta para descubrir la función génica en el maíz.

Descripción breve de las figuras La Figura 1 proporciona la identificación de información respecto a los genes y/o promotores MS45, MS26, 5126 y BS7

de Zea mays, Or y za sativa y Arabidopsis thaliana.

La Figura 2 representa el mantenimiento de la mutación homocigota recesiva en plantas androestériles para la producción de híbridos.

La Figura 3 muestra que pIR de MS45 de arroz es eficaz en la supresión del promotor correspondiente de arroz pero no de maíz.

La Figura 4 es un esquema de un vector genérico de complementación/supresión.

La Figura 5 es un esquema de un ejemplo de un vector de complementación/supresión de MS45.

La Figura 6 es un esquema que muestra el diseño de un vector para el mantenimiento de genes letales recesivos.

Resumen de la invención La invención proporciona un método para controlar la expresión de una variante alélica de un gen de interés en una plana o célula de planta, que comprende:

(a) silenciar dicho gen de interés usando una construcción pIR dirigida al promotor que dirige la expresión de dicho gen de interés; y

(b) expresar recombinantemente dicha variante alélica unida operativamente a un segundo promotor; preferiblemente en el que dicho gen de interés es un gen endógeno. La invención también proporciona una pareja de plantas en el que la primera planta comprende:

(a) un primer promotor unido operativamente a un gen de interés;

(b) una construcción pIR dirigida a dicho primer promotor;

(c) una construcción que comprende un segundo promotor unido operativamente a una variante alélica del gen de interés; y

la segunda planta comprende una construcción pIR dirigida al segundo promotor.

La notación ARNhp tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula de ARN en horquilla de promotor y puede usarse indistintamente con la notación "pIR" para repetición invertida de promotor.

Un método de la invención puede llevarse a la práctica usando células únicas que contienen el gen de interés, o puede llevarse a la práctica usando un organismo que contiene la célula. El organismo puede ser cualquier organismo de interés en el que se expresa el gen de interés. En una realización, la célula es una célula de planta, que puede ser una célula de planta in vitro o puede ser una o más células de una planta in situ. En una realización, el organismo es una planta transgénica, que contiene la primera molécula de ácido nucleico exógena integrada de manera estable en su genoma. En un aspecto de esta realización, la planta transgénica contiene además, integrada en su genoma, una segunda molécula de ácido nucleico exógena (que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido codificado por el gen de interés) unida operativamente a un segundo promotor heterólogo, en el que, después de la expresión de la segunda molécula de ácido nucleico exógena a partir del segundo promotor heterólogo, se restaura el fenotipo salvaje.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se ha discutido anteriormente, la invención se refiere a un método para controlar la expresión de una variante alélica de un gen de interés en una planta o célula de planta y para una pareja de plantas como se ha definido anteriormente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "endógeno", cuando se usa en referencia a un gen, significa un gen que está presente normalmente en el genoma de las células de un organismo especificado y está presente en su estado normal en las células (es decir, está presente en el genoma en el estado en el que está presente normalmente en la naturaleza) . El término "exógeno" se usa en la presente memoria para referirse a cualquier material que se introduce en una célula. El término "molécula de ácido nucleico exógena" o " transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que no está presente normalmente en el genoma de una célula o se introduce en una célula. Dichas moléculas de ácido nucleico exógenas son generalmente moléculas de ácido nucleico recombinantes, que se generan usando métodos de ADN recombinante como se describe en la presente memoria o conocidos de otra manera en la técnica. En varias realizaciones, un organismo no humano transgénico como se describe en la presente memoria, puede contener, por ejemplo, un primer transgén y un segundo transgén. Dichos primer y segundo transgenes pueden introducirse en una célula, por ejemplo, una célula progenitora de un organismo transgénico, bien como moléculas de ácido nucleico individuales o como una única unidad (por ejemplo, contenidas en diferentes vectores o contenidas en un único vector, respectivamente) . En cualquier caso, puede confirmarse que una célula de la que se va a obtener el organismo transgénico contiene ambos transgenes usando métodos rutinarios y muy conocidos tales como expresión de genes marcadores o hibridación de ácido nucleico o análisis por PCR. Alternativamente, o adicionalmente, la confirmación de la presencia de transgenes puede ocurrir más tarde, por ejemplo, después de la regeneración de una planta a partir de una célula potencialmente transformada.

Como ejemplo, la inactivación de los genes de fertilidad endógenos puede efectuarse por la expresión de moléculas de ARN en horquilla (ARNhp) en células de los órganos reproductores de una planta (por ejemplo, células del estambre en las que los genes de la fertilidad endógenos que se van a inactivar son genes de la fertilidad masculina) . El estambre, que comprende el órgano reproductor masculino de las plantas, incluye varios tipos de células, incluyendo, por ejemplo, el filamento, antera, tapete y polen. Los ARNhp útiles para los propósitos de la presente invención se diseñan para incluir repeticiones invertidas de un promotor del gen endógeno que se va a inactivar; se han descrito ARNhp que tienen la capacidad de suprimir la expresión de un gen (véase, por ejemplo, Matzke, et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11: 221-227; Scheid, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99: 13659-13662; Waterhouse y Helliwell (2003) Nature Reviews Genetics 4: 29-38; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99 (4) : 16499-16506; Sijen, et al., (2001) Curr. Biol. 11: 436-440) . Como se describe en la presente memoria, el uso de promotores específicos del estambre o preferidos del estambre, incluyendo promotores específicos de la antera, promotores específicos del polen, promotores específicos del tapete y semejantes, permite la expresión de ARNhp en plantas (particularmente en células reproductoras masculinas de la planta) , en el que el ARNhp suprime la expresión de un gen de fertilidad endógeno, inactivando de esta manera la expresión del gen de fertilidad endógeno. Como tal, la supresión usando un ARNhp específico de un promotor que dirige la expresión de un gen de fertilidad proporciona un medio para inactivar un gen de fertilidad endógeno.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" o "secuencia de nucleótidos" se refiere ampliamente a una secuencia de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que están unidos entre sí por un enlace fosfodiéster. Como tal, los términos incluyen ARN y ADN, que pueden ser un gen o una parte de éste, un ADNc, una secuencia de ácido polidesoxirribonucleico sintética, o semejantes, y puede ser monocatenario o bicatenario, así como un híbrido ADN/ARN. Además, los términos se usan en la presente memoria para incluir moléculas de ácido nucleico naturales, que pueden aislarse de una célula, así como moléculas sintéticas, que pueden prepararse, por ejemplo, por métodos de síntesis química o por métodos enzimáticos tales como por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . El término "recombinante" se usa en la presente memoria para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico que se manipula fuera de una célula, incluyendo dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas unidas. El término "heterólogo" se usa en la presente memoria para hacer referencia a secuencias de nucleótidos que normalmente no están unidas en la naturaleza o, si están unidas,... [Seguir leyendo]

1. Un método para controlar la expresión de una variante alélica de un gen de interés en una planta o célula de planta, que comprende:

(a) silenciar dicho gen de interés usando una construcción pIR dirigida al promotor que dirige la expresión de dicho gen 5 de interés; y

(b) expresar recombinantemente dicha variante alélica unida operativamente a un segundo promotor.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicho gen de interés es un gen endógeno.

3. Una pareja de plantas en la que la primera planta comprende:

(a) un primer promotor unido operativamente a un gen de interés; 10 (b) una construcción pIR dirigida a dicho primer promotor;

(c) una construcción que comprende un segundo promotor unido operativamente a una variante alélica del gen de interés; y la segunda planta comprende una construcción pIR dirigida al segundo promotor.