TERAPIA FOTODINÁMICA QUE UTILIZA QUIMIOLUMINISCENCIA Y UN CONJUGADO LIGANDO-FOTOSENSIBILIZANTE.

Terapia fotodinámica que utiliza quimioluminiscencia y un conjugado ligando-fotosensibilizante Campo de la invención La presente invención hace referencia a un método para destruir de forma selectiva células diana mediante un tratamiento combinado que utiliza un conjugado ligando-toxina y un agente quimioluminiscente, donde el conjugado comprende un fotosensibilizante, como la hematoporfirina. Estado de la técnica La baja especificidad dirigida de los agentes quimioterapéuticos ha estimulado el desarrollo de estrategias de transporte dirigido de fármacos como los conjugados ligando-toxina (CLT), que implican el acoplamiento de una molécula efectora con un ligando transportador que está dirigido a un receptor específico de la célula diana [véase, p. ej., Mrsny R.J.: Expert Opinion on Biological Therapy 4 (2004) 65-73]. Los ligandos como las pequeñas moléculas tienen ventajas sobre otras moléculas mayores como los anticuerpos. Los presentes inventores han informado recientemente del uso de CLTs que contienen pequeñas moléculas para la destrucción dirigida de células plasmáticas [Firer M.A. et al.: Leukemia and Lymphoma 44 (2003) 681-9], sugiriendo que este enfoque puede ser aplicable para el tratamiento del mieloma múltiple. La estrategia CLT representa uno de los aspectos de la presente invención. Otro aspecto implica la Terapia Fotodinámica (TFD), un procedimiento de dos fases basado en dos componentes no tóxicos que se combinan para inducir alteraciones en la membrana que conducen a la citólisis. El primer componente es una molécula fotosensibilizante (Fs), generalmente un derivado de la porfirina, que transfiere la energía al oxígeno molecular cuando se activa mediante luz, produciendo especies reactivas de oxígeno que causan un daño directo a los componentes celulares, concretamente a los fosfolípidos de membrana. Se cree que la TFD actúa en la destrucción de las células tumorales mediante, al menos, dos mecanismos adicionales: destrucción de las células tumorales vasculares, y la inducción de las reacciones antitumorales inflamatoria e inmune. Tanto la historia, como el mecanismo de acción y las aplicaciones biomédicas de la TFD han sido objeto de varias revisiones [véase, p. ej., Sharman W.M. et al.: Adv. Drug Delivery Rev. 56 (2004) 53-76]. Existen dos grandes problemas que limitan el amplio uso de la TFD como una modalidad de tratamiento. En primer lugar, dado que los fotosensibilizantes tienden a acumularse en el tejido tumoral, su uso clínico puede verse descartado debido a los efectos secundarios tóxicos. Para superar este problema, se une el Fs de forma covalente a moléculas transportadoras para que se localice el efecto de la TFD en una célula diana [P. ej., Brown S.B. et al.: (2004). Lancet Oncol. 5 (2004) 497-508]. Un sistema de transportador proteína-receptor atractivo para este propósito utiliza la interacción de alta afinidad entre la transferrina (Tf) transportadora de hierro y su receptor de superficie celular (RTf, CD71). Como todas las células en división necesitan un suministro continuo de hierro para su metabolismo, no es sorprendente que el RTf esté sobre-expresado en una gran variedad de células malignas [Ponka P. et al.: Sem. Hematol. 35 (1998) 35-54], por lo que se ha utilizado el sistema Tf-RTf en varios formatos para dirigir compuestos Fs a diferentes tipos de células malignas [Hamblin M.R. et al: J. Photochem. Photobiol. 26 (1994) 45-56; Rittenhouse- Diakun K. et al.: Treat. Vol. 72 ,N°2, March 2002, pages 117-130, xP00242 1374; Gijsens A. et al.: Int. J. Cancer. 101 (2002) 78-85; Li H. et al.: Med. Res. Rev. 22 (2002) 225-50]. El segundo gran problema en relación a la TFD es la limitada penetración en el tejido de la luz externa. A pesar de los avances en el desarrollo de dispositivos de luz externa para fototerapia, y del exitoso uso clínico de la TFD en cánceres periféricos y en dermatología, el tratamiento de tejidos internos permanece limitado a procedimientos invasivos, como el uso de catéteres. Ha habido intentos de desarrollar enfoques moleculares para la activación del Fs. Carpenter [Carpenter S. et al.: Proc. Natl. Acad Sci. USA Vol, 91, December 1994 (1994-12), pages 12273-12277, XP001187053 ISSN: 0027-8424] empleó la activación bioluminiscente intracelular de la hipericina y la posterior destrucción de las células dermales equinas, mientras que Phillip [Phillip M.J. et al.: Oncology 46 (1989) 266-72] utilizó un derivado de la hematoporfirina (Fotofrina II) y una solución multi-componente para inducir la QL intracelular en adenocarcinomas de mama. Sin embargo, los sistemas existentes no proporcionan suficiente especificidad ni eficiencia en la TFD. Por lo tanto, uno de los objetivos de esta invención es proporcionar un bioconjugado con parámetros significativamente mejores. Se ha utilizado exitosamente el luminol (5-amino-2-3-dihidro-1,4-ftalazinediona) en varios análisis de sistemas basados en QL [Kricka J.L.: Ann. Clin. Biochem. 39 (2002) 114-29; Templin M.F. et al.: Drug. Discov. Today 7 (2002) 815-22]. El mecanismo de la reacción QL del luminol se conoce desde hace tiempo, y aunque se han examinado algunos aspectos físico-químicos de la activación del luminol en macrófagos [Nemeth A. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 255 (1999) 360-6], nunca se ha explotado la relación luminol-TFD para inducir citotoxicidad por TFD en células tumorales. Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar una TFD que comprensa un CLT y un agente quimioluminiscente. Theodossiou Theodossis et al relaciona la luciferina de luciérnaga activada por rosa de bengala y la terapia fotodinámica in vitro mediante quimioluminiscencia intracelular en células NIH 3T3 transgénicas; Cancer Research, vol. 63, no. 8, April 15, 2003 (2003-04-15), pages 1818-1821, XP002421372 ISSN 0008-5472. Otros objetivos y ventajas de la presente invención aparecerán según avanza la descripción. 2 E06728287 22-12-2011   Resumen de la invención La invención proporciona un método para destruir células diana seleccionadas que comprende los pasos de i) exponer dichas células a un agente activador quimioluminiscente (AQ), y ii) unir a dichas células un conjugado ligando-toxina (CLT) que comprende un fotosensibilizante (Fs) y un ligando conjugado a éste. Dicho AQ produce luz quimioluminiscente, que activa a dicho Fs, el cual, transfiere energía al oxígeno molecular y produce especies reactivas de oxígeno, causando daño a dichas células diana. Estos AQ producen luz reaccionando con las especies de oxígeno presentes in situ. En el método de la invención, los pasos i) y ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea. Además, el AQ y el CLT pueden unirse de varias maneras. Dicho CLT comprende un ligando que es una pequeña molécula, péptido o proteína, u otro factor que tenga afinidad con un componente de la superficie de la célula diana, como la transferrina, el cual se pretende unir a un receptor celular específico como el receptor de la transferrina en dichas células diana. Este CLT comprende, preferiblemente, hematoporfirina como Fs. En un aspecto preferido de la invención, el CLT en un método para destruir células diana comprende transferrina y hematoporfirina. Las células que van a ser destruidas están relacionadas preferiblemente con una enfermedad proliferativa. Dichas células pueden formar parte de la sangre, la piel, tejidos internos, o de forma alternativa, de un cultivo celular. La invención proporciona un método para destruir células cancerígenas. También esta descrito en la invención el tratamiento de un sujeto con una enfermedad asociada a una proliferación o actividad celular no deseada, que comprende la administración a dicho sujeto de dos componentes: un CLT que comprende un Fs, y un AQ. La administración de este CLT y de este AQ puede llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea. También pueden asociarse el CLT y el AQ juntos. Dicho CLT comprende preferiblemente transferrina. Dicho Fs comprende preferiblemente hematoporfirina. En un aspecto preferido, se asocian en dicho CLT la transferrina y la hematoporfirina. Dicha enfermedad puede ser una enfermedad cancerígena o una hiperplasia. Esta enfermedad puede incluir desórdenes en los que la proliferación celular contribuye a la patogénesis, incluyendo aterosclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática, escleroderma, cirrosis, endometriosis, neovascularización y tumores. La invención también hace referencia al uso combinado de un CLT que comprende un Fs, y un AQ para el tratamiento del cáncer, donde dicho CLT comprende preferiblemente transferrina y hematoporfirina. Dicho AQ puede emparejarse con dicho CLT, por ejemplo, mediante un enlace covalente. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado ligando-toxina para ser usado en... [Seguir leyendo]

1. Uso de un conjugado ligando-toxina (CLT) que comprende un fotosensibilizante (Fs) y un ligando conjugado a éste, en combinación con un agente quimioluminiscente que reacciona con las especies de oxígeno presentes in situ y produce luz quimioluminiscente, donde dicho Fs transfiere energía al oxígeno molecular y produce especies reactivas de oxígeno cuando es activado por la luz por dicho agente quimioluminiscente, en la producción de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado a una proliferación incrementada de una población celular, donde dicho ligando tiene afinidad por un componente de la superficie de una célula de dicha población celular, destruyendo así las células en dicha población celular. 2. Uso según la reivindicación 1, donde dicho trastorno está asociado con el cáncer o una hiperplasia. 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho conjugado ligando-toxina y dicho agente quimioluminiscente se utilizan en cualquier orden o simultáneamente. 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho ligando en dicho conjugado ligando-toxina comprende un péptido. 5. Uso según la reivindicación 4, donde dicho péptido es reconocido por un receptor de la superficie de dichas células diana. 6. Uso según la reivindicación 4, donde dicho péptido es transferrina. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho Fs comprende hematoporfirina. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho conjugado ligando-toxina comprende transferrina y hematoporfirina conjugada a ésta. 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho agente quimioluminiscente comprende luminol. 10. Uso según la reivindicación 8, donde dicho agente quimioluminiscente comprende luminol. 11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho agente quimioluminiscente es seleccionado del grupo que consiste en luminol, isoluminol y lucigenina. 12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho agente quimioluminiscente está acoplado a dicho conjugado ligando-toxina. 13. Uso según la reivindicación 1, donde dichas células están asociadas a un desorden proliferativo. 14. Uso según la reivindicación 13, donde dichas células son células cancerígenas. 15. Uso según la reivindicación 13, donde dichas células pertenecen a tejidos corporales internos. 16. Uso según la reivindicación 13, donde dichas células pertenecen a la piel. 17. Uso según la reivindicación 10, donde la DL50 de dicho conjugado ligando-toxina es más de 6 veces menor que la DL50 para la hematoporfirina. 18. Uso según la reivindicación 17, donde dicha DL50 de dicho conjugado ligando-toxina es casi 20 veces menor que dicha DL50 para la hematoporfirina. 19. Uso según la reivindicación 10, donde dicho conjugado ligando-toxina y dicho agente quimioluminiscente actúan de forma sinérgica en la destrucción de las células diana. 20. Composición farmacéutica para ser usada en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, en combinación con un conjugado ligando-toxina que comprende un fotosensibilizante (Fs) y un ligando conjugado a éste, la composición comprende luminol como agente quimioluminiscente que activa in situ a dicho conjugado ligandotoxina, donde dicho Fs transfiere energía al oxígeno molecular y produce especies reactivas de oxígeno cuando es activado por la luz por dicho luminol, y dicho ligando tiene afinidad por un componente de la superficie de una célula. 21. Composición farmacéutica que comprende un conjugado ligando-toxina que comprende un fotosensibilizante y un ligando conjugado a éste, dicho conjugado ligando-toxina tiene un agente quimioluminiscente acoplado a éste, el cual reacciona con las especies de oxígeno presentes in situ y produce luz quimioluminiscente, donde dicho 8 E06728287 22-12-2011   fotosensibilizante transfiere energía al oxígeno molecular y produce especies reactivas de oxígeno cuando es activado por la luz por dicho agente quimioluminiscente, y dicho ligando tiene afinidad por un componente de la superficie de una célula 9 E06728287 22-12-2011   E06728287 22-12-2011   Citotoxicidad celular % 11 22-12-2011 Concentración de Hp solo o en Hp-Tf (M) E06728287   Citotoxicidad celular % 12 Concentración de Hp solo o en Hp-Tf (M) E06728287 22-12-2011   Parámetro Concentración a DL50 (M) Hp Tf-Hp Proporción# Concentración a DL90 (M) Hp Tf-Hp Proporción# Concentración a DLMÁX (M) Hp Tf-Hp Proporción# % Citotoxicidad Celular a DLMÁX Hp Tf-Hp Proporción# Tabla 1 13 Tipo celular FL K-562 U-7 0.55 0.08 6.88 NA 0.18 ------- 0.89 0.45 1.98 84 0.84 1.9 0.3 6.33 7.5 1.0 7.5 7.5 3.75 2.0 0.90 #: Proporción de Hp/Tf-Hp NA: No alcanzado Fig. 3 NA 0.5 ----- NA >3.5 ------ 3.0 3.0 1.0 0.47 E06728287 22-12-2011   Hp solo Hp + luminol Tf-Hp solo Tf-Hp + luminol Citotoxicidad celular % 14 Concentración de Hp solo o en Hp-Tf (M) E06728287 22-12-2011   % Citotoxicidad celular Concentración de Tf-Hp (M) Concentración de luminol (M) E06728287 22-12-2011   -Tf-Hp, -luminol +Tf-Hp, -luminol -Tf-Hp, +luminol +Tf-Hp, +luminol Retraso en la adición de luminol (mins) Citotoxicidad celular % 16 Hp-Tf, sin luminol Luminol + Hp-Tf, sin lavado Luminol + Hp-Tf, con lavado Conc. de Tf-Hp añadida tras 24 hrs (M) E06728287 22-12-2011   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto. Literatura no patente citada en la descripción MRSNY R.J. Expert Opinion on Biological Therapy, 2004, vol. 4, 65-73 [0002] FIRER M.A. et al. Leukemia and Lymphoma, 2003, vol. 44, 681-9 [0002] SHARMAN W.M. et al. Adv. Drug Delivery Rev., 2004, vol. 56, 53-76 [0002] BROWN S.B. et al. Lancet Oncol., 2004, vol. 5, 497- 508 [0002] PONKA P. et al. Sem. Hematol., 1998, vol. 35, 35- 54 [0002] HAMBLIN M.R. et al. J. Photochem. Photobiol., 1994, vol. 26, 45-56 [0002] [0018] RITTENHOUSE-DIAKUN K. et al. Treat., March 2002, vol. 72 (2), 117-130 [0002] GIJSENS A. et al. Int. J. Cancer., 2002, vol. 101, 78-85 [0002] LI H. et al. Med. Res. Rev., 2002, vol. 22, 225-50 [0002] CARPENTER S. et al. Proc. Natl. Acad Sci. 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