Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que comprende al menos un primer sitiode recombinacion FRT que comprende la SEC ID No 21 y un segundo sitio de recombinacion FRT que comprende la5 SEC ID No 39.

Sitios de recombinación FRT modificados y métodos de uso.

5 Campo de la invención

La invención se refiere a sistemas de recombinación específica de sitio y métodos de uso.

Antecedentes

La inserción aleatoria de ADN introducido en el genoma de una célula hospedadora puede ser letal si el ADN foráneo resulta que se inserta en, y por tanto muta, un gen nativo críticamente importante. Además, incluso si un acontecimiento de inserción aleatoria no altera el funcionamiento de un gen de un célula hospedadora, la expresión de una secuencia de nucleótidos foránea insertada puede verse influenciada por efectos de posición causados por el

ADN genómico adyacente. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos se inserta en un sitio en el que el efecto de posición es suficientemente fuerte para suprimir la función o regulación de la secuencia de nucleótidos introducida. En otros casos, la sobreproducción del producto génico tiene efectos negativos en una célula.

Por ejemplo, en plantas, los efectos de posición pueden provocar una agronómica reducida, costes adicionales para investigación adicional, creación de eventos transgénicos adicionales, y un tiempo más lento de producción. Por estas razones, se necesitan métodos eficaces para dirigir la inserción de secuencias de nucleótidos en el genoma de diversos organismos, tales como plantas, en posiciones cromosómicas que permitan la función deseada de la secuencia de interés.

Schlake. T. y Bode, J. (Biochem. (1994) 33:12746-51) describe el uso de sitios de reconocimiento de FLP (FRT) mutados para el intercambio de casetes de expresión en loci cromosómicos definidos.

Sumario

Se proporcionan métodos y composiciones que usan poblaciones de sitios de recombinación FRT modificados aleatorizados para identificar, aislar y/o caracterizar sitios de recombinación FRT modificados. También se proporcionan sitios de recombinación FRT modificados recombinogénicos que pueden emplearse en una diversidad de métodos para recombinación dirigida de polinucleótidos de interés, incluyendo métodos para recombinar polinucleótidos, evaluar la actividad promotora, seleccionar directamente organismos transformados, minimizar o

eliminar la expresión resultante de la integración aleatoria en el genoma de un organismo, tal como una planta, eliminar polinucleótidos de interés, combinar múltiples casetes de transferencia, invertir o escindir un polinucleótido, e identificar y/o caracterizar regiones reguladoras de la transcripción.

La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un primer sitio de recombinación FRT que comprende la SEC ID Nº 21 y un segundo sitio de recombinación FRT que comprende la SEC ID Nº 39.

La invención proporciona adicionalmente una célula que comprende el polinucleótido de la invención.

45 La invención proporciona adicionalmente una planta que comprende una célula de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un método para dirigir la inserción de un polinucleótido de interés a un sitio diana, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una célula que tiene integrado establemente en su genoma el sitio diana que comprende una primer sitio de recombinación que comprende la SEC ID Nº 21 y un segundo sitio de recombinación que comprende la SEC ID Nº 39;

(b) proporcionar un casete de transferencia que comprende el polinucleótido de interés, donde dicho polinucleótido de interés está flanqueado por dicho primer y dicho segundo sitios de recombinación; y

55 (c) proporcionar una recombinasa FLP, donde dicha recombinasa reconoce y lleva a cabo la recombinación en el primer y el segundo sitios de recombinación, y el polinucleótido de interés se inserta en el sitio diana.

Descripción detallada

La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un primer sitio de recombinación FRT modificado funcional que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 21 y un segundo sitio de combinación FRT que comprende la SEC ID Nº 39.

También se proporcionan organismos, incluyendo, por ejemplo, procariotas, tales como bacterias, y eucariotas, tales

65 como levaduras, plantas, células vegetales, y semillas que comprenden los polinucleótidos mencionados que comprende los sitios de recombinación FRT modificados. En ejemplos específicos, los polinucleótidos se integran de

forma estable en el genoma del organismo.

Se proporciona un método para dirigir la inserción de un polinucleótido de interés. El método comprende proporcionar un sitio diana que tiene un primer y segundo sitios de recombinación funcionales de la invención. Se 5 proporciona un casete de transferencia que comprende un polinucleótido de interés y los dos sitios de recombinación funcionales, donde el segundo sitio de recombinación funcional es recombinogénico con el primer sitio de recombinación funcional, y el primer y/o el segundo sitio de recombinación comprenden un sitio FRT modificado descrito en este documento. Se proporciona al menos una recombinasa. La recombinasa reconoce y lleva a cabo la recombinación en el primer y segundo sitios de recombinación. El método puede suceden in vitro o in vivo. Los sitios de recombinación funcionales se integran de forma estable en el genoma de una célula en el sitio diana. En algunos ejemplos, el polinucleótido de interés y/o la diana puede posteriormente escindirse, invertirse, o modificarse de otro modo, por ejemplo, mediante la adición de un segundo polinucleótido de interés en el sitio diana.

Se ha caracterizado el sitio de recombinación FRT mínimo de tipo silvestre y comprende una serie de dominios que

incluyen la siguiente secuencia de nucleótidos 5'-AGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACT-3' (SEC ID Nº 39) . Los dominios del sitio de recombinación FRT mínimo comprende un par de elementos de simetría de 11 pares de bases que son los sitios de unión de FLP (nucleótidos 1-11 y 20-30 de la SEC ID Nº 39) ; el núcleo de 8 pares de bases, o región espaciadora (nucleótidos 12-19 de la SEC ID Nº 39) ; y, las extensiones de polipirimidina (nucleótidos 3-14 y nucleótidos 16-29 de la SEC ID Nº 39) . Un sitio de recombinación FRT modificado puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más alteraciones que incluyen sustituciones, adiciones, y/o deleciones en uno o más de estos dominios.

Se proporciona un sitio de recombinación FRT modificado. Un sitio de recombinación FRT modificado es una secuencia de nucleótidos que es similar pero no idéntica al sitio de recombinación FRT nativo mínimo expuesto en la

SEC ID Nº 39. El sitio de recombinación FRT modificado retiene la actividad biológica del sitio de recombinación FRT de tipo silvestre y comprende un sitio de recombinación funcional que lo reconoce una recombinasa FLP y capaz de una reacción de recombinación mediada por recombinasa. El sitio de recombinación FRT modificado comprende una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos en el sitio de recombinación FRT nativo mínimo. El sitio de recombinación FRT modificado comprende la SEC ID Nº 21. Generalmente, los sitios de recombinación modificados tendrán al menos aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, de identidad de secuencia con el sitio de recombinación nativo mínimo sobre su longitud completa.

El sitio de recombinación FRT modificado tiene sustituciones de nucleótidos a través de la longitud completa del sitio 35 de recombinación mínimo.

El sitio de recombinación FRT modificado tiene alteraciones en el dominio espaciador de 8 pares de bases. El dominio espaciador modificado de FRT12 se expone en la SEC ID Nº 1. El sitio FRT modificado es funcional. El sitio de recombinación FRT modificado comprende la región espaciadora expuesta en la SEC ID Nº 1 y comprende adicionalmente sitios de unión a FLP en elemento de simetría que corresponden a los encontrados en el sitio de recombinación FRT nativo mínimo. Véanse, las SEC ID Nº 19 y 20 que muestran secuencias de elemento de simetría de tipo silvestre. El sitio de recombinación FRT modificado se expone en la SEC ID Nº... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un primer sitio

de recombinación FRT que comprende la SEC ID Nº 21 y un segundo sitio de recombinación FRT que comprende la 5 SEC ID Nº 39.

2. Una célula que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

3. La célula de la reivindicación 2, en la que la célula es de una planta. 10

4. Una planta que comprende la célula de la reivindicación 3.

5. La célula de la reivindicación 3, en la que la célula vegetal es de una planta seleccionada entre maíz, arroz, trigo,

cebada, mijo, sorgo, centeno, soja, alfalfa, colza, Arabidopsis, tabaco, girasol, algodón, y cártamo. 15

6. Un método para dirigir la inserción de un polinucleótido de interés a un sitio diana, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una célula que tiene integrado de forma estable en su genoma el sitio diana que comprende un

primer sitio de recombinación que comprende la SEC ID Nº 21 y un segundo sitio de recombinación que comprende 20 la SEC ID Nº39;

(b) proporcionar un casete de transferencia que comprende el polinucleótido de interés, en el que dicho polinucleótido de interés está flanqueado por dicho primer y dicho segundo sitios de recombinación; y

(c) proporcionar una recombinasa FLP, en el que dicha recombinasa reconoce y lleva a cabo la recombinación en el

primer y el segundo sitios de recombinación, y el polinucleótido de interés se inserta en el sitio diana. 25

7. El método de la reivindicación 6, en el que la célula es de una planta seleccionada entre maíz, arroz, trigo, cebada, mijo, sorgo, centeno, soja, alfalfa, colza, Arabidopsis, tabaco, girasol, algodón, y cártamo.

8. El método de la reivindicación 6 ó 7, en el que proporcionar el casete de transferencia o la recombinasa FLP 30 comprende transformación.