SEPARACIÓN EN COMPARTIMENTOS POR CARACTERIZACIÓN DE PÍXEL USANDO AGRUPAMIENTO DE DATOS DE IMÁGENES.

Separación en compartimentos por caracterización de píxel usando agrupamiento de datos de imágenes Aplicación relacionada [0001] La presente aplicación reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense con número de serie: 60/917,853, solicitado el 14 de mayo de 2007. Antecedentes de la invención [0002] El análisis cuantitativo automatizado de la expresión de biomarcador en las secciones de tejido o microarrays tisulares presenta diferentes desafíos, incluyendo heterogeneidad de secciones de tejido, localización subcelular de coloración y la presencia de señal de fondo. Por ejemplo, dependiendo del tipo de tumor o sección del tejido que está siendo analizado, el área de interés puede representar casi la muestra entera o sólo un pequeño porcentaje. Por ejemplo, un carcinoma pancreático o carcinoma lobular del pecho con respuesta desmoplástica sustancial puede mostrar tejido estromal que representa un porcentaje grande del área total. Si el objetivo del ensayo es determinar la expresión de la célula epitelial de un marcador dado, un protocolo debe usarse que valore sólo esa región. El protocolo no sólo debe ser capaz de seleccionar la región de interés, sino también normalizarla, de modo que el nivel de expresión leído de cualquier área dada se pueda comparar con la de otras áreas. La localización subcelular presenta desafíos similares. Sistemas automatizados y métodos para analizar rápidamente secciones de tejido, incluyendo microarrays tisulares, que permiten la identificación y la localización de marcadores biológicos identificados dentro de compartimentos subcelulares en tejidos y otras células con muestras, se necesitan. Un primer documento de la técnica anterior es la publicación de la patente internacional WO2006/083969 que divulga un método para la discriminación de características morfológicas presentes en una muestra biológica de interés usando metodologías basadas en fluorescencia, mediante la substracción de una máscara de imagen nuclear de una máscara de imagen de campo luminoso. Otro documento de la técnica anterior es la publicación de la patente internacional WO2006/133325 que divulga un método para análisis de tejido desde el margen quirúrgico de tumor resecado, y el uso de esta información para predecir recurrencia, supervivencia y eficacia del tratamiento en pacientes con cáncer. [0003] Determinados métodos (incluyendo microscopia confocal convolución/deconvolución) se ha usado para cuantificar la expresión de proteínas a nivel celular (o subcelular) dentro de un único campo de alta potencia. Estos métodos, no obstante, son computacionalmente técnicas intensivas y laboriosas que operan imágenes múltiples en serie. Como resultado, el estándar actual para análisis de inmunohistología es análisis patológico convencional basado y clasificación de la muestra según escala. [0004] Sistemas automatizados para análisis histológico de secciones de tejido incluyen frecuentemente métodos que o tienen 1) un operador que examina una imagen de un campo de visión de un tejido teñido y parámetros de ajuste para condiciones de análisis óptimas, o 2) ajustes constantes que tratan un conjunto de datos entero de la misma manera, pero un operador sigue siendo requerido para hacer llamadas de decisión en el ajuste de los parámetros iniciales, es decir, umbrales. Ambos métodos padecen al menos la desventaja de que los datos no están siendo tratados por un único método constante que sea completamente objetivo. Estas decisiones pueden influir en la salida del sistema y afectar a la calidad de los datos. Ellos también añaden una capa extra de complejidad del sistema en el que los métodos de análisis se pueden ajustar a experimentos individuales o muestras individuales y ningún método universal se usa. Resumen de la invención [0005] La presente invención se refiere en general a métodos de detección y cuantificación de expresión de proteína y de identificación de compartimentos biológicos definidos por marcador. Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos de compartimentos de definición en los que la expresión de biomarcador se localiza y cuantifica en tejidos y células con muestras, que requieren intervención mínima de usuario y proporcionan compartimento óptimo, incluyendo resolución de compartimento subcelular. [0006] En una forma de realización, la presente invención se refiere a un método para la definición de un primer compartimento biológico definido por marcador en relación a un segundo compartimento biológico definido por marcador presente en una muestra biológica de interés, comprendiendo comparación de la intensidad en cada uno de los lugares de píxel en una primera imagen de alta resolución del primer compartimento biológico definido por marcador con la intensidad en cada uno de los lugares de píxel correspondiente a una segunda imagen de alta resolución del segundo compartimento biológico definido por marcador, en el que la primera imagen de alta resolución se preparó usando un primer agente de imágenes que es específico para el primer compartimento biológico definido por marcador, y en el que la segunda imagen de alta resolución se preparó usando un segundo agente de imágenes que es específico para el segundo compartimento biológico definido por marcador, en el que 2 E08754418 28-12-2011   diferencias en la intensidad del píxel definen el primer compartimento biológico definido por marcador en relación al segundo compartimento biológico definido por marcador. En una forma de realización particular, el método es automatizado, por ejemplo, en el que el método se implementa por un ordenador. En una forma de realización particular, los píxeles de las dos imágenes de alta resolución se representan en un gráfico, en los que los ejes del gráfico comprenden la intensidad del primer agente de imágenes y la intensidad del segundo agente de imágenes. En formas de realización particulares, los métodos de la presente invención comprenden opcionalmente i) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad alta del primer agente de imágenes e intensidad baja del segundo agente de imágenes en el primer compartimento; ii) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad alta del segundo agente de imágenes e intensidad baja del primer agente de imágenes en el segundo compartimento; y iii) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad baja del primer agente de imágenes e intensidad baja del segundo agente de imágenes en fondo y eliminación de estos píxeles de análisis posterior. En una forma de realización particular, cualquiera de los pasos de asignación son realizados usando un algoritmo de agrupamiento, por ejemplo, una k significa método de agrupación para determinar un miembro de agrupación por cada píxel. En una forma de realización particular, los métodos de la invención comprenden opcionalmente la asignación de píxeles restantes intensidad de primer agente de imágenes e intensidad de segundo agente de imágenes para el primer compartimento o el segundo compartimento se basan en probabilidad. En una forma de realización particular, los métodos de la invención comprenden opcionalmente la asignación de esos píxeles restantes con intensidad de primer agente de imágenes e intensidad de segundo agente de imágenes ni para el primer compartimento ni para el segundo compartimento. En una forma de realización particular, el compartimento biológico se selecciona del grupo consistente en: un tipo celular, compartimento subcelular, un compartimento tisular y un compartimento celular o tisular localizado. En una forma de realización particular, el compartimento biológico es un compartimento subcelular seleccionado del grupo consistente en: núcleo celular, citoplasma, membrana nuclear, membrana celular, mitocondria, retículo endoplasmático, peroxisoma y lisosoma. En una forma de realización particular, el compartimento biológico es un compartimento tisular seleccionado del grupo consistente en: epitelio, estroma, mesotelio. En una forma de realización particular, la muestra es una muestra de tejido, preparación celular o fracción subcelular. En una forma de realización particular, los métodos de la invención comprenden opcionalmente la definición de una máscara definida por la intensidad de píxel del primer y/o segundo agente de imágenes y definición de asignación de compartimento para sólo esos píxeles en la máscara. En una forma de realización particular, los métodos de la invención comprenden opcionalmente la incubación de la muestra con un primer agente de imágenes que específicamente etiqueta el primer compartimento biológico definido por marcador, un segundo agente de imágenes que específicamente... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación de compartimentos biológicos definidos por marcadores por medio de la definición de un primer compartimento biológico definido por marcador en relación a un segundo compartimento biológico definido por marcador presente en una muestra biológica de interés, comprendiendo la comparación de la intensidad en cada uno de los lugares de píxel en una primera imagen de alta resolución del primer compartimento biológico definido por marcador con la intensidad en cada uno de los lugares de píxel correspondientes de una segunda imagen de alta resolución del segundo compartimento biológico definido por marcador, caracterizado por el hecho de que la primera imagen de alta resolución ha sido preparada usando un primer agente de imágenes que es específico para el primer compartimento biológico definido por marcador, y donde la segunda imagen de alta resolución ha sido preparada usando un segundo agente de imágenes que es específico para el segundo compartimento biológico definido por marcador, donde diferencias en la intensidad de píxel definen el primer compartimento biológico definido por marcador en relación al segundo compartimento biológico definido por marcador. 2. Método según la reivindicación 1, donde los píxeles de las dos imágenes de alta resolución se representan en un gráfico, donde los ejes del gráfico comprenden la intensidad del primer agente de imágenes y la intensidad del segundo agente de imágenes. 3. Método según la reivindicación 1, comprendiendo además: i) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad alta de primer agente de imágenes e intensidad baja de segundo agente de imágenes en el primer compartimento; ii) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad alta de segundo agente de imágenes e intensidad baja de primer agente de imágenes en el segundo compartimento; y iii) asignación de píxeles a una agrupación caracterizada por el hecho de intensidad baja de primer agente de imágenes e intensidad baja de segundo agente de imágenes en el fondo y eliminación de estos píxeles de análisis posterior. 4. Método según la reivindicación 3, donde cualquiera de los pasos de asignación se realiza usando un algoritmo de agrupamiento. 5. Método según la reivindicación 4, donde cualquiera de los pasos de asignación se realiza usando método de agrupamiento de las k medias para determinar un miembro de agrupación para cada píxel. 6. Método según la reivindicación 3, comprendiendo además asignación de píxeles restantes con intensidad del primer agente de imágenes e intensidad del segundo agente de imágenes para el primer compartimento o el segundo compartimento basado en probabilidad. 7. Método según la reivindicación 3, comprendiendo además asignación de los píxeles restantes con intensidad de primer agente de imágenes e intensidad de segundo agente de imágenes ni para el primer compartimento ni para el segundo compartimento. 8. Método según la reivindicación 1, comprendiendo además definición de una máscara definida por la intensidad de píxel del primer y/o segundo agente de imágenes y definición de asignación del compartimento sólo para los píxeles en la máscara. 9. Método según la reivindicación 1, comprendiendo además incubación de la muestra con un primer agente de imágenes que específicamente etiqueta el primer compartimento biológico definido por marcador, un segundo agente de imágenes que específicamente etiqueta un segundo compartimento biológico definido por marcador. 10. Método según la reivindicación 1, donde un biomarcador particular en el primer compartimento biológico definido por marcador en relación al segundo compartimento biológico definido por marcador se localiza y se cuantifica por: a) incubación de un tercer agente de imágenes que específicamente etiqueta el biomarcador; b) obtención de una tercera imagen de alta resolución de la muestra etiquetada del tercer agente de imágenes; d) realización de un análisis de agrupamiento en los píxeles para asignar píxeles al primer compartimento definido con marcador o el segundo compartimento definido con marcador; y e) análisis en la tercera imagen de los lugares de píxel asignados a los compartimentos con el fin de identificar los lugares de píxel con un valor de intensidad indicativo del tercer agente de imágenes, y 28 E08754418 28-12-2011   determinación del valor de la intensidad total de la tercera imagen en los lugares de píxel asignados a cada uno de los primeros y segundos compartimentos, con el fin de localizar y cuantificar el biomarcador en el primer compartimento en relación al segundo compartimento. 11. Método según la reivindicación 10, donde el análisis de agrupación se realiza usando agrupamiento de k medias reiterativas en la primera y la segunda intensidad de píxel en cada uno de los lugares de píxel para calcular tres centroides usando distancias euclídeas o distancias de logaritmo de verosimilitud. 12. Método según la reivindicación 11, comprendiendo además: i) representación en el gráfico de los lugares de píxel y los centroides calculados donde los del gráfico comprenden la intensidad del primer agente de imágenes y la intensidad del segundo agente de imágenes en lugares de píxel para el primer compartimento y el segundo compartimento; ii) conexión de los centroides para definición de un triángulo; iii) asignación de los lugares de píxel con una intensidad que no se encuentra en el área del triángulo: (1) al primer compartimento si la intensidad de píxel es sustancialmente indicativa del primer agente de imágenes; (2) al segundo compartimento si la intensidad de píxel es sustancialmente indicativa del segundo agente de imágenes, o (3) para cualquier compartimento si la intensidad de píxel es sustancialmente indicativa de fondo; y iv) asignación de los lugares de píxel en el área del triángulo en el primer compartimento o el segundo compartimento basada en un valor correspondiente a la probabilidad de que el píxel se origine desde el primer o el segundo compartimento. 14. 29 E08754418 28-12-2011   E08754418 28-12-2011   31 E08754418 28-12-2011   32 E08754418 28-12-2011   33 E08754418 28-12-2011   34 E08754418 28-12-2011   E08754418 28-12-2011   36 E08754418 28-12-2011   37 E08754418 28-12-2011   38 E08754418 28-12-2011   39 E08754418 28-12-2011   E08754418 28-12-2011   41 E08754418 28-12-2011   42 E08754418 28-12-2011   43 E08754418 28-12-2011   44 E08754418 28-12-2011   E08754418 28-12-2011   46 E08754418 28-12-2011   47 E08754418 28-12-2011   48 E08754418 28-12-2011