Secuencias genéticas de flavonoide 3'',5''-hidroxilasa y usos de las mismas.

Un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3'5'H,

comprendiendo dichométodo la transformación estable de una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende unasecuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3', 5'hidroxilasa (F3'5'H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de lalista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia deaminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidosseleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajocondiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una plantatransgénica desde la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes parapermitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en untejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidinamedidas mediante una técnica cromatográfica.

Secuencias genéticas de flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se relaciona en general con una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de flavonoide 3', 5'-hidroxilasa (F3'5'H) y con el uso de la secuencia genética y/o sus correspondientes polipéptidos inter alia para manipular el color en las flores o partes de las mismas o en otros tejidos de plantas. Más particularmente, el F3'5'H tiene la capacidad de modular el metabolismo del dihidrocanferol (DHK) así como el metabolismo de otros sustratos tales como dihidroquercetina (DHQ) , naringenina y eriodictol. Aún más particularmente, la presente invención proporciona una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H cuando se expresa en rosas. La invención presente se relaciona adicionalmente con moléculas antisentido y sentido o moléculas inductoras de ARNi que corresponden a todo o parte de las secuencias genéticas objetivo o un transcripto de la misma así como a plantas genéticamente modificadas así como flores para corte, partes y tejido reproductivo de tales plantas. También se discuten promotores que operan eficientemente en plantas tales como rosa, gerbera o plantas relacionadas botánicamente.

Descripción de la técnica anterior La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en ningún país.

Los detalles bibliográficos de referencias previstas en la especificación tratada aparecen como una lista al final de la especificación.

La industria de las flores o las plantas ornamentales procura desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una manera efectiva de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de las flores. Las técnicas de cruzamiento clásicas han sido utilizadas con algún éxito para producir un amplio rango de colores de casi todas las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles hoy. Esta metodología ha estado limitada, sin embargo, por las restricciones de la reserva genética particular de la especie y por esta razón es raro que una especie individual tenga un espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de plantas o partes de plantas tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa tanto los mercados de flores cortadas como ornamentales. En la industria de las flores o plantas ornamentales, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de especies principales con florescencia tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, claveles, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, pelargonio, iris, impatiens y ciclamen sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gerbera azul para el mercado de las cortadas.

Además, el desarrollo de novedosas variedades coloreadas de plantas tales como vegetales, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, semillas novedosas coloreadas serían útiles como marcas de propiedad para plantas. Modificaciones adicionales a flavonoides comunes a bayas o frutas incluyendo uvas y manzanas y sus zumos incluyendo el vino tendrían el potencial de impartir características de estilo modificadas de valor a tales frutas e industrias de subproductos.

El color de las flores predominantemente debido a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a un amplio rango de colores desde amarillo hasta rojo hasta azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas, las cuales son derivadas glicosilados de cianidina y su derivado peonidina metilado, moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas están localizadas en las vacuolas de las células epidérmicas de los pétalos o en las vacuolas de las células subepidérmicas de las hojas.

Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides (ruta de los flavonoides) está bien establecida, (Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol et al., Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a; and Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestra en las Figuras 1A y B. Estas reacciones y enzimas están involucradas en la conversión de la fenilalanina a p-coumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos claves en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio-liasa (PAL) , cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4cumarato: CoA ligasa (4CL) . La primera etapa comprometida en la ruta involucra la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (provista por la acción de la acetil COA carboxilasa (ACC) sobre acetil CoA y CO2) con una molécula de p-cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS) . El producto de esta relación, la 2’, 4, 4’, 6’, tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza de manera muy rápida debido a la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina es hidroxilada subsecuentemente en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocampferol (DHK) .

El patrón de hidroxilación del anillo B del dihidrocampferol (DHK) juega un papel clave en la determinación del color de los pétalos. El anillo B puede ser hidroxilado bien sea en las posiciones 3’, o en las posiciones 3’ y 5’ juntas, para producir dihidroquercetina (DHQ) o dihidromiricetina (DHM) , respectivamente. Las dos enzimas clave involucradas en esta parte de la ruta son la 3’-hidroxilasa y flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa, ambos de la clase de citocromo P450 de las enzimas. Las enzimas citocromo P450 tienen amplia distribución en la naturaleza y se han aislado y secuenciado genes a partir de vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.

La flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que lleva a los pigmentos basados en cianidina los cuales, en muchas especies vegetales (por ejemplo Rosa spp., Dianthus spp., Petunia spp., begonia, ciclamem, impatiens, gloria de la mañana y crisantemo) contribuyen al color rojo y rosa de las flores.

La flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (F3’5’H) es una enzima clave en la ruta de flavonoides que lleva a los pigmentos basados en delfinidina los cuales, en muchas especies de plantas (por ejemplo, petunia spp, Viola spp., Lisianthus spp., Gentiana spp., Sollya spp., Salvia spp., Clitoria spp., Kennedia spp., Campanula spp., Lavandula spp., Verbena spp., Torenia spp., Delphinium spp., Solanum spp., Cineraria spp., Vitis spp., Babiana stricia, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium sp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Catharanthus spp., Malvia spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Gymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp. Antigonon spp., Pisum spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.) contribuyen al color púrpura y azul en las flores. Muchas especies tales como rosas, gerberas, crisantemos y claveles no producen pigmentos basados en delfinidina porque carecen de una actividad de F3’5’H.

La siguiente etapa en la ruta, que lleva la producción de las antocianinas coloreadas a partir de los dihidroflovonoides (DHK, DHK, DHM) involucra la dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que lleva a la producción de las leucoantocianidinas. Las leucoantocianidinas se convierten subsecuentemente en antocianidinas, pelargonidina, cianidina y delfinidina o moléculas basadas en delfinidina. Estas moléculas de flavonoide son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición 3, a través de la acción de las glicosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren las unidades estructurales... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3’5’H, comprendiendo dicho método la transformación estable de una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una planta transgénica desde la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina medidas mediante una técnica cromatográfica.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de las mismas bajo condiciones de alta restricción.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 o 2 donde la molécula de ácido nucleico es derivada de una planta seleccionada de Viola spp y Salvia spp.

4. Un método para producir una planta de rosa transgénica que exhibe propiedades de florescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, regenerando una planta transgénica desde la célula y cultivando dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la molécula de ácido nucleico.

5. Una planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente que comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. La planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente de la reivindicación 5, donde la parte de planta es seleccionada del grupo que comprende sépalo, bráctea, peciolo, pedúnculo, ovarios, antenas, flores, frutos, nueces, raíces, tallos, hojas y semillas.

7. Uso de una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la manufactura de un constructo genético capaz de expresar la F3’5’H en una planta de rosa.

8. Un extracto de una planta o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente de la reivindicación 5 o reivindicación 6.

9. El extracto de la reivindicación 8, donde el extracto es un saborizante o un aditivo para alimentos o un producto para la salud o una bebida o jugo o colorante o pigmento o pintura o tinte.

10. Un organismo eucariote no humano que porta una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de F3’5’H de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 extracromosómicamente en forma de plásmido.

11. El uso de una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la manufactura de una planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente.

12. La planta o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente de la reivindicación 5, donde la planta o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente exhiben flores o inflorescencia alteradas.

13. Uso de un molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la identificación de un material genético que codifica una F3’5’H.

14. Uso de una molécula de ácido nucleico definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la amplificación y clonación de material genético que codifica una F3’5’H.

15. Progenie de la planta modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 12, donde dicha progenie comprende dicha molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

16. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es

complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina medidas mediante una técnica cromatográfica.

17. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 16, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de las mismas bajo condiciones de alta restricción.

18. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 16 o 17 donde la molécula de ácido nucleico es derivada de Salvia spp.

19. Un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende: (i) un promotor que es operable en

tejidos de pétalo de rosa y donde dicho promotor está enlazado operativamente a, (ii) una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. El constructo de la reivindicación 19, donde dicho promotor es seleccionado del grupo consistente de CHS de rosa, CHS de crisantemo y CaMV 35S.

21. Un constructo de la reivindicación 20, donde dicho promotor comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 30.

22. Una F3’5’H aislada codificada por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

Replicón: pBluescript SK (+) vector 2.95 kb Inserto: Homólogos de ∼1.8kb de ADNc de F3'5'H petHf1 de P-hybrida

cv. OGB Figura 2

Replicón: pBluescript SK (+) vector 2.95 kb Inserto: Homólogos de ∼1.8kb de ADNc de F3'5'H petHf2 de P-hybrida

cv. OGB Figura 3

Replicón: vector de pPU19 de ∼2, 7kb de EcoRI

Inserto: fragmento de ∼1.6kb de BspHI (romo) /Fspl que contiene ADNc de F3'5'H petHf1 de pCGP601 de petunia Figura 4 Replicón: vector pWTT2132 de SmaI de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de Pstl (romo) de ∼3.5 kb que contiene gen AmCHS5’:petHf1:petD 8 3’ de pCGP485 Figura 5

Figura 6

Replicón: Fragmento de vector romo (BamHI/Hbal) de 2.95 kb de pBluescript II KS (+)

Inserto: Fragmento (romo) de Pstl de ∼3.5kb que contine gen AmCHS 5’:petHF1: petD8 3’ de pCGP483

Figura 7 Replicón: vector de SmaI pWTT2132 de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento (romo) de Pstl de ∼3.9 kb que contiene gen Mac:petHf1 : mas 3’ de pCGP628 Figura 8 Replicón: vector de SmaI pWTT2132 de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de Xbal (romo) /Pstl de ∼5.3 kb que contiene gen petD8 5’:petHf1 : petD8 3’ de pCGP1107 Figura 9 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl (romo) /Kpnl de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de Sacl (romo) /Knpl de ∼4, 35 kb que contiene gen short FSL 5’:petHf1 : petFSL 3’ de pCGP1107 Figura 10 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl (romo) /BamHI de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de Pstl/BamHI de ∼3 kb que contiene gen petRT5’:petHf1 : nos 3’ de pCGP846 Figura 11 Replicón: vector pWTT2132 de Sall de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de XhoI de ∼4, 9 kb que contiene gen mas/35S :petHf1 : ocs 3’ de pCGP1619 Figura 12 Replicón: vector pWTT2132 de SmaI de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento romo de (Pstl/EcoRI) de ∼2, 6 kb que contiene gen CaMV 35S :petHf1 : ocs 3’ de pCGP1636 Figura 13 Replicón: vector pWTT2132 de BamHI de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de BgIII de ∼4, 9 kb que contiene gen RoseCHS 5’ :petHf1 : nos 3’ de pCGP200 Figura 14

Replicón: vector pCGP1988 de Asp718 (romo) de ∼18.7 kb Inserto: Fragmento romo de (Asp718/Xbal) de ∼3, 7 kb que contiene gen CaMV 35S :petHf2 : ocs 3’ de pCGP2109 Figura 15

Replicón: fragmento de vector pWTT2132 de SaII (romo) /Pstl de ∼18.7 kb

Inserto: Fragmento de (EcoRI (romo) /Pstl) de ∼66 bp que contiene sitio de clonación múltiple de pNEB193

Figura 16

Replicón: fragmento de vector Hincll/Xhol de ∼3, 3 kb de pGCP2000 (que contiene fragmento promotor CaMV 35S en pBluescript SK) Inserto: Fragmento de EcoRI (romo) /Xhol ocs 3’ de ∼1, 6 kb de pKIWI101 Figura 17

Replicón: vector pCGN1548 de HindIII/Pstl de ∼15 kb Inserto: Fragmento de HindIII/Pstl de ∼5, 3 kb que contiene gen petD8 5’: GUS: petD8 3’ de pCGP1106 Figura 18

Replicón: vector pBIN19 de BamHI (lleno con GA) /SacI de ∼11, 8 kb

Inserto: Fragmento de Xhol (leno con TC) /SacI de ∼6, 7 kb que contiene gen longpetFSL 5’: GUS: petFSL 3’ de pCGP496 Figura 19 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl/BamHI de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de Pstl/BgIII de ∼4, 6 kb que contiene gen Chr y sCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP1622 Figura 20 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de Pstl de ∼5, 4 kb que contiene gen pet RT 5’: GUS: petRT 3’ de pCGP1628 Figura 21

Replicón: vector pWTT2132 de BamHI de ∼18, 7 kb Inserto: Fragmento de BgIII de ∼5 kb que contiene gen RoseCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP197 Figura 22

Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb Inserto: Fragmento romo (EagI/Pstl) de ∼3, 8 kb que contiene gen AmCHS 5’: GUS: petD8 3’ de pCGP1952 Figura 23

Figura 24

Replicón: vector pBluescript SK II (+) de ∼2, 95 kb

Inserto: ADNc de pansyF3'5'H BP#18 de ∼1, 6 kb de Viola spp. Cv. Pensamiento negro Figura 25 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de ∼2, 95 kb

Inserto: ADNc de pansyF3'5'H BP#40 de ∼1, 6 kb de Viola spp. Cv. Pensamiento negro Figura 26

Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb Inserto: Fragmento de Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 8 kb que contiene gen AmCHS 5’: BP#18: petD8 3’ de pCGP1970 Figura 27

Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 8 kb que contiene gen AmCHS 5’: BP#40: petD8 3’ de pCGP1971

Figura 28

Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S: BP#18: ocs 3’ de pCGP1965

Figura 29

Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S: BP#40: ocs 3’ de pCGP1966 Figura 30

Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SaI#2 de ∼1.6 kb de Salvia spp. Figura 31 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SaI#47 de ∼1.6 kb de Salvia spp. Figura 32 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#2: petD8 3’ de pCGP2116 Figura 33 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#47: petD8 3’ de pCGP2117 Figura 34 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento (Xhol/Xbal) romo de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#2: petD8 3’ de pCGP2112 Figura 35 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento (Xhol/Xbal) romo de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#47: petD8 3’ de pCGP2111 Figura 36

Replicón: vector Bluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SoII#5 de ∼1.7 kb de Sllya spp. Figura 37 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 5 kb que contiene gen AmCHS 5’: SoII#5: petD8 3’ de pCGP2128 Figura 38 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento (Asp718/Xbal) (romo) /EcoRV de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S’: SoII#5: ocs 3’ de pCGP2129 Figura 39

Replicón: vector Bluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H Kenn#31 de ∼1.7 kb de Kennedia spp. Figura 40 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento (Notl/EcoRI) romo de ∼3, 7 kb que contiene gen AmCHS 5’: Kenn#31: petD8 3’ de pCGP2242 Figura 41 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento (Xhol/Notl) romo de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S: Kenn#31: ocs 3’ de pCGP2236

Figura 42 Replicón: vector pBHF2 BamHI/Pstl de 4.5 kb + inserto parcial BpeaHF2 (esqueleto= vector pBluescript SK II (+) )

Inserto: fragmento BamHI/Pstl de ∼200 bp de PCR usando pBHF2 como molde (fragmento 5’ de ADNc de F3'5'H de campanilla (BpeaHF2) de Clitoria termata incluyendo el codón de iniciación putativo (ATG) )

Figura 43 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’: BpeaHF2:: petD8 3’ de pCGP2133 Figura 44 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12, 8 kb (esqueleto pBI121)

Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.7 kb que contiene clon de ADNc de F3'5'H BpeaHF2 de pBHF2F Figura 45 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de (Xhol/Xbal) romo de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S’: BpeaHF2: petD8 3’ de pCGP2132

Figura 46 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H Gent#48 de ∼1.7 kb de Gentiana triflora Figura 47 Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento de Notl (romo) /EcoRV de ∼3, 6 kb que contiene gen AmCHS 5’Gen#48: petD8 3’ de pCGP1496 Figura 48 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12, 8 kb (esqueleto pBI121)

Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.8 kb que contiene clon de ADNc de F3'5'H (Genn#48) de pG48 Figura 49 Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18, 7 kb

Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3, 6 kb que contiene gen CaMV 35S:Gen#48: ocs 3’ de pCGP1981 Figura 50

Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de lavanda F3'5'H LBG de ∼1.7 kb de Lavendula nil Figura 51 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12, 8 kb (esqueleto pBI121)

Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.8 kb que contiene clon de ADNc de lavanda F3'5'H (LBG) de pLHF8 Figura 52