Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que actúa como un modulador de un compuesto que se almacena en la semilla en una planta,

en donde el nivel del compuesto que se almacena en la semilla se incrementa, seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2;

(c) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4;

(d) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 5;

(e) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3;

(f) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6;

(g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polinucleótido de cualquiera de (e) hasta (f), en donde la longitud de la comparación de secuencia es la longitud completa del polipéptido de cualquiera de (e) hasta (f); y

(h) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de (a) hasta (g).

Reguladores del metabolismo de lípidos en plantas.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general al metabolismo de los compuestos que se almacenan en las semillas en las plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleico que codifican a las proteínas reguladoras del metabolismo de lípidos y el uso de estas secuencias en la producción de plantas transgénicas.

Antecedentes de la invención El estudio y la manipulación genética de las plantas tiene una larga historia que comenzó incluso antes de que los estudios famosos de Gregor Mendel en el siglo 19. En el perfeccionamiento de esta ciencia, los científicos han logrado modificaciones de características particulares de las plantas que van desde los tubérculos de la patata que tienen mayor contenido de almidón hasta plantas oleaginosas como la canola y el girasol que tienen un mayor contenido o un contenido alterado de ácidos grasos. Con el aumento en el consumo y el uso de aceites vegetales, la modificación del contenido de aceite en las semillas y del nivel de aceite en las semillas se ha vuelto cada vez más generalizada. La producción o composición de aceite de semillas ha sido modificado en numerosas plantas tradicionales de semillas oleaginosas como la soja (Patente de EE.UU. N º 5.955.650) , canola (Patente de EE.UU. No. 5.955.650) , girasol (Patente de EE.UU. No. 6.084.164) y colza (Toepfer et al. 1995, Science 268: 681 - 686) , así como plantas de semillas oleaginosas no tradicionales, tales como tabaco (Cahoon et al. 1992, Proc. Natl. Acad. EE.UU. 89: 11184 - 11188) .

Los aceites de las semillas de las plantas contienen tanto lípidos neutros como polares (véase la Tabla 1) . Los lípidos neutros de la semilla contienen principalmente triacilglicerol, que es el lípido almacenado principal que se acumula en los cuerpos oleosos en las semillas. Los lípidos polares se encuentran principalmente en las diversas membranas de las células de las semillas, por ejemplo, el retículo endoplasmático, las membranas microsómicas y la membrana celular. Los lípidos neutros y polares contienen varios ácidos grasos comunes (véase la Tabla 2) y una variedad de ácidos grasos menos comunes. La composición de ácidos grasos de los lípidos de la membrana está muy regulada y sólo un número selecto de los ácidos grasos se encuentran en los lípidos de la membrana. Por otro lado, un gran número de ácidos grasos inusuales pueden ser incorporados en los lípidos neutros que se almacenan en las semillas de muchas especies de plantas (Van de Loo, F. J. et al. 1993, Unusual Fatty Acids in Lipid Metabolism in Plants, páginas 91 - 126, editor TS Moore Jr. CRC Press) .

Los lípidos se sintetizan a partir de ácidos grasos y su síntesis se puede dividir en dos partes: la ruta procariota y la ruta eucariota (J Ohlrogge Browse & J 1995, Lipid Biosynthesis Plant Cell 7: 957 - 970) . La ruta procarióta está localizada en los plástidos que son el sitio primario de la biosíntesis de ácidos grasos. La síntesis de ácidos grasos comienza con la conversión de acetil-CoA a malonil-CoA por medio de la acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) . La malonil-CoA se convierte en malonil-ACP por medio de la malonil-CoA:ACP transacilasa. La enzima beta-ceto-acilACP-sintetasa III (KAS III) cataliza una reacción de condensación en la cual se transfiere el grupo acilo de la acetil-CoA a la malonil-ACP para formar 3-cetobutiril-ACP. En una serie posterior de reacciones de condensación, reducción y deshidratación, la cadena naciente de ácido graso sobre el cofactor ACP se alarga por medio de la adición paso a paso (condensación) de dos átomos de carbono donados por la malonil-ACP hasta que se forma una cadena saturada de ácido graso de 16 a18 carbonos. La delta-9-acil-ACP desaturasa plastidial introduce el primer doble enlace insaturado en el ácido graso. Las tioesterasas escinden los ácidos grasos a partir del cofactor ACP y se exportan los ácidos grasos libres al citoplasma, donde participan como ésteres grasos de acil-CoA en la ruta eucariota. En esta ruta se esterifican los ácidos grasos por medio de la glicerol-3-fosfato aciltransferasa y la aciltransferasa del ácido lisofosfatídico en las posiciones sn-1 y sn-2 del glicerol-3-fosfato, respectivamente, para producir ácido fosfatídico (PA) . El PA es el precursor de otros lípidos polares y neutros, siendo este último formado en la ruta de Kennedy (Shanklin y Cahoon 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611 - 641; Voelker 1996, Genetic Engineering ed.: J. K. Setlow 18:111 - 13; Frentzen 1998, Lipid 100 (4 - 5) : 161 - 166) .

La acetil-CoA en los plástidos es la precursora central para la biosíntesis de lípidos. La acetil-CoA se puede formar en los plástidos por medio de reacciones diferentes y la contribución exacta de cada reacción se sigue debatiendo (J & J Ohlrogge Navega 1995, Lipid Biosynthesis Plant Cell 7: 957 - 970) . Sin embargo, se acepta que una gran parte de la acetil-CoA se deriva de la glucosa-6-fosfato y piruvato (es decir fosfoenolpiruvato) que se importan desde el citoplasma dentro de los plástidos. La sacarosa se produce en los órganos fuente (hojas, donde se realiza la fotosíntesis) , y es transportada a las semillas en desarrollo que también son denominados órganos que se hunden. En las semillas en desarrollo, la sacarosa es el precursor de todos los compuestos de almacenamiento, es decir, almidón; lípidos y parcialmente las proteínas que se almacenan en las semillas. Por lo tanto, es claro que el metabolismo de carbohidratos en el cual la sacarosa juega un papel central es muy importante para la acumulación de compuestos que se almacenan en la semilla.

Aunque el contenido de lípidos y de ácido graso del aceite de la semilla puede ser modificado por medio de métodos tradicionales de fitomejoramiento de plantas, la llegada de la tecnología del ADN recombinante ha permitido una manipulación más fácil del contenido de aceite de la semilla de una planta, y en algunos casos, ha permitido la alteración de los aceites de la semilla en formas que no podrían llevarse a cabo solamente mediante fitomejoramiento. Por ejemplo, la introducción de una secuencia de ácido nucleico para L12-hidroxilasa en tabaco transgénico dio como resultado la introducción de un ácido graso novedoso, ácido ricinoleico, en el aceite de la semilla de tabaco (Van de Loo, et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 6743 - 6747) . Las plantas de tabaco también han sido modificadas por ingeniería genética para producir bajos niveles de ácido petroselínico por medio de la introducción y expresión de una acil-ACP desaturasa del cilantro (Cahoon et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 11184 - 11188) .

La modificación del contenido de aceite de la semilla en las plantas tiene importantes ramificaciones médicas, nutricionales y económicas. Con respecto a las ramificaciones médicas, los ácidos grasos de cadena larga (C18 y mayores) que se encuentran en muchos aceites de semilla se han vinculados a la reducción de la hipercolesterolemia y otros trastornos clínicos relacionados con la enfermedad cardíaca coronaria (Brenner R. R. 1976, Adv. Exp. Med. Biol. 83: 85 - 101) . Por lo tanto, el consumo de una planta que tiene niveles elevados de estos tipos de ácidos grasos puede reducir el riesgo de una enfermedad cardíaca. Niveles más altos del contenido de aceite en la semilla también aumentan la producción a gran escala y por lo tanto reducen el costo de estos aceites.

Con el fin de aumentar o alterar los niveles de compuestos tales como el aceite en la semilla en las plantas, se deben identificar las secuencias de ácido nucleico y las proteínas relacionadas con el metabolismo de ácido graso y de lípidos. Como se mencionó anteriormente, se han clonado varios ácidos nucleicos para desaturasa tales como el ácido nucleico para L6-desaturasa, el ácido nucleico para L12-desaturasa y el ácido nucleico para acil-ACP desaturasa y se demostró que codifican las enzimas necesarias para la síntesis de ácidos grasos en varias especies de plantas. Se han clonado también secuencias de ácido nucleico para oleosina a partir de especies tan diferentes como Brassica, soja, zanahoria, pino y Arabidopsis también y se determinó que codifican proteínas asociadas con la membrana monocapa de fosfolípidos de los cuerpos oleosos en esas plantas.

Aunque se han clonado e identificado varios ácidos nucleicos que están involucrados en etapas enzimáticas del metabolismo de lípidos, ácidos grasos y almidones, probablemente existen una multitud de tales ácidos nucleicos de las plantas que todavía deben ser identificados.... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que actúa como un modulador de un compuesto que se almacena en la semilla en una planta, en donde el nivel del compuesto que se almacena en la semilla se incrementa, seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2;

(c) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4;

(d) un polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 5;

(e) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3;

(f) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6;

(g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polinucleótido de cualquiera de (e) hasta (f) , en donde la longitud de la comparación de secuencia es la longitud completa del polipéptido de cualquiera de (e) hasta (f) ; y

(h) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de (a) hasta (g) .

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4.

5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 5.

6. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3.

7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6.

8. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.

9. Un primer ácido nucleico aislado que hibrida bajo condiciones rigurosas hasta un segundo ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a) un segundo ácido nucleico que comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, y

(b) un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido como es descrito por la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 6 donde el primer ácido nucleico codifica un polipéptido que actúa como un modulador de un compuesto que se almacena en la semilla en una planta,

en donde las condiciones rigurosas comprenden el lavado a 62º C durante 30 minutos cada vez en SSC 3 veces/SDS al 0, 1%, SSG 1 vez/SDS al 0, 1% y SSC 1 vez, SDS al 1%.

10. Un vector de expresión recombinante que comprende al ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la expresión del vector en una célula huésped modifica un nivel de un compuesto que se almacena en la semilla en la célula huésped, en donde el compuesto que se almacena en la semilla se selecciona de entre el grupo que consiste de un lípido, un ácido graso, un almidón y una proteína que se almacena en la semilla.

11. La proteína del vector de expresión recombinante de la reivindicación 10, en el que la célula huésped es una célula de una planta.

12. Una célula de una planta transgénica que comprende un transgén que consiste de un polinucleótido como se duvulga en la reivindicación 1.

13. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 12, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado un nivel modificado de un compuesto que se almacena en la semilla en la célula de la planta comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta.

14. Una planta transgénica que comprende un transgén que consiste de un polinucleótido como el divulgado en la reivindicación 1.

15. La planta transgénica de la reivindicación 14, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

16. La planta transgénica de la reivindicación 14, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

17. La planta transgénica de la reivindicación 14, donde la planta es de una especie productora de aceite.

18. La planta transgénica de la reivindicación 14, en donde la planta se selecciona de entre el grupo que consiste de colza, canola, linaza, soja, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, pimienta, Tagetes, algodón, palma oleaginosa, palma cocotera, lino, ricino y maní.

19. La planta transgénica de la reivindicación 14, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado un nivel modificado de un compuesto que se almacena en la semilla en la planta en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

20. La planta transgénica de la reivindicación 19, en donde el compuesto que se almacena en la semilla se se selecciona de entre el grupo que consiste de un lípido, un ácido graso, un almidón y una proteína que se almacena en la semilla.

21. Una semilla producida por la planta transgénica de la reivindicación 19, en donde la semilla contiene la secuencia de polinucleótidos la planta es de una línea genéticamente pura para un nivel modificado del compuesto que se almacena en la semilla en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

22. Un método para producir una planta transgénica que tiene un nivel modificado de un compuesto que se almacena en la semilla que comprende la transformación de una célula de una planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico y la generación a partir de la célula de la planta de la planta transgénica, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado de entre el grupo consistente de:

(a) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1;

(b) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2;

(c) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4;

(d) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 5;

(e) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3;

(f) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6;

(g) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polinucleótido de cualquiera de a) hasta d) , en donde la longitud de comparación de la secuencia es la longitud completa de la región de codificación;

(h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de cualquiera de e) hasta f) , en donde la longitud de comparación de la secuencia es la longitud completa del polipéptido de cualquiera de (e) hasta (f) ; e

(i) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta h) .

23. El método de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2.

24. El método de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4.

25. El método de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3.

26. El método de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6.

27. El método de la reivindicación 22, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

28. El método de la reivindicación 22, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

29. El método de la reivindicación 23, en donde la planta es de una especie productora de aceite.

30. El método de la reivindicación 22, en donde la planta se selecciona de entre el grupo que consiste de colza, canola, linaza, soja, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, pimienta, Tagetes, algodón, palma oleaginosa, palma de coco, lino, ricino y maní.

31. El método de la reivindicación 22, en donde el nivel del compuesto que se almacena en la semilla se incrementa.

32. El método de la reivindicación 22, donde el compuesto que se almacena en la semilla se selecciona de entre el grupo que consiste en un lípido, un ácido graso, un almidón y una proteína que se almacena en la semilla.

33. Un método de modulación del nivel de un compuesto que se almacena en la semilla en una planta que comprende, la modificación de la expresión de un ácido nucleico en la planta, en donde el ácido nucleico se selecciona de entre el grupo que consiste de:

(a) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 1;

(b) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2;

(c) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4;

(d) el polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 5;

(e) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 3;

(f) un polinucleótido que codifica al polipéptido como el descrito por la SEQ ID NO: 6;

(g) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polinucleótido de cualquiera de a) hasta d) , en donde la longitud de comparación de la secuencia es la longitud completa de la región de codificación;

(h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de cualquiera de e) hasta f) ; en donde la longitud de comparación de la secuencia es la longitud completa del polipéptido de cualquiera de (e) hasta (f) ; e

(i) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta h) .

34. El método de la reivindicación 33, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 2.

35. El método de la reivindicación 33, en donde el ácido nucleico comprende al polinucleótido como el descrito por la SEQ ID NO: 4.

36. El método de la reivindicación 33, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 3.

37. El método de la reivindicación 33, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 6.

38. El método de la reivindicación 33, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

39. El método de la reivindicación 33, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

40. El método de la reivindicación 33, en donde la planta es de una especie productora de aceite.

41. El método de la reivindicación 33, en donde la planta se selecciona de entre el grupo que consiste de colza, canola, linaza, soja, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, pimienta, Tagetes, algodón, palma oleaginosa, palma de coco, lino, ricino y maní.

42. El método de la reivindicación 33, en donde el nivel del compuesto que se almacena en la semilla se incrementa.

43. El método de la reivindicación 33, donde el compuesto que se almacena en la semilla se selecciona de entre el grupo que consiste en un lípido, un ácido graso, un almidón y una proteína que se almacena en la semilla.

44. El método de la reivindicación 33, en el que la planta es transgénica.

45. El método de la reivindicación 33, en donde la planta no es transgénica.

FIGURA 3

Alineamiento de secuencias de una secuencia de proteína LMR (WRI1, SEQ ID NO: 3) y secuencias candidatas de LMR SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9

FIGURA 3 (CONTINUACIÓN)

FIGURA 4A

Secuencia de nucleótidos de un ADNc para LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1)

FIGURA 4B

Secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto de un ADNc para LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2)

FIGURA 4C

Secuencia de aminoácidos de una proteína LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3)

FIGURA 5A

Secuencia de nucleótidos de un ADNc para LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4)

FIGURA 5B

Secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto de un ADNc para LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 5)

FIGURA 5C

Secuencia de aminoácidos de una proteína LMR de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 6)

FIGURA 6

Secuencia de ácidos nucleicos truncada del clon BAC T12E18 (GenBank, número de acceso AL132971) (SEQ ID NO: 7)

FIGURA 6 (CONTINUACIÓN)

FIGURA 6 (CONTINUACIÓN) FIGURA 6 (CONTINUACIÓN)