REACTIVOS DE MARCADO CON COLORANTES DE CIANINA.

La presente invención se refiere al campo de los reactivos de marcado, en particular colorantes reactivos con cianina que tienen uno o varios grupos solubilizantes unidos a los anteriores y a los procedimientos que utilizan dichos colorantes. Las marcas fluorescentes se han instituido como los medios de detección de elección en el análisis con micromatrices. Existen numerosos procedimientos diferentes para producir sondas de ácidos nucleicos marcadas con colorantes fluorescentes. Entre estos se incluyen la incorporación directa de nucleótidos marcados con colorantes en el ADNc mediante un sistema enzimático de transcriptasa inversa. Una alternativa es una solución de marcado indirecto y utiliza un análogo de nucleótido químicamente reactivo (por ejemplo, aminoalil-dUTP) o un análogo de nucleótido biotinilado que se incorpora a una primera cadena de ADNc durante la síntesis, seguido por el marcado posterior con marcas de colorantes reactivos o de afinidad, que se unen tanto covalentemente como no covalentemente con el nucleótido modificado. Las estrategias de marcado posterior en el análisis con micromatrices tienen el potencial de ofrecer una sensibilidad mejorada de detección, especialmente para dianas poco expresadas y permiten el uso de menos ARNm. Sigue existiendo, sin embargo una necesidad de procedimientos de detección ultrasensibles tales como los que se pueden obtener mediante el uso de múltiples marcas, tanto mediante marcado químico de la molécula de ácido nucleico, como mediante el uso de conjugados de avidina o estreptavidina. Los colorantes con cianina ofrecen numerosas ventajas sobre otros colorantes fluorescentes. Los espectros de excitación y emisión de los colorantes con cianina amplían el espectro visible y en el infrarrojo cercano desde 450 nm a 800 nm. Además, los colorantes con cianina están caracterizados por tener coeficientes de extinción muy elevados, rendimientos cuánticos favorables y buena fotoestabilidad. Véanse por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N os 6048982, 5268486, 5569587, (Waggoner, A.S. y col). Aunque el marcado posterior puede dar como resultado un elevado nivel de incorporación del colorante con cianina en el ADNc, o en la estreptavidina, existe sin embargo una tendencia hacia la autoasociación de algunos colorantes en solución o en la interfase sólido-líquido, lo que conduce a una reducción de los rendimientos cuánticos de la fluorescencia (Mishra, A. y col, Chem. Rev., (2000), 100(6), 1973- 2012; Gruber, H. y col, Bioconjugate Chemistry, (2000), 11, 696-704). El documento WO 02/26891 (Molecular Probes Inc.) describe colorantes con carbocianina modificados y sus conjugados con materiales diana, en los que existe al menos un sistema de anillo de indolinio sustituido, en el que el sustituyente en la posición 3 del anillo del indolinio contiene un grupo químicamente reactivo o una sustancia conjugada. Los colorantes modificados de acuerdo con el documento WO 02/26891, se informa que superan la tendencia de los colorantes con cianina de autoasociarse (es decir, apilarse) y los conjugados de colorantes marcados con los colorantes modificados se informa que son más fluorescentes que los conjugados marcados con colorantes con carbocianina estructuralmente similares. La Patente de los Estados Unidos 6083485 (Lichia y col.) se refiere a un procedimiento diagnóstico in vivo basado en la radiación del infrarrojo cercano (IRC) que usa colorantes que tienen la siguiente estructura: en la que los grupos X e Y incluyen los grupos -C(CH2R 32 )(CH2R 33 ) y los grupos R 20 a R 29 , R 32 y R 33 se pueden sustituir por grupos que incluyen restos hidroxilo, carboxilo, ácido sulfónico, carboxialquilo, alcoxicarbonilo o alcoxioxoalquilo que contienen hasta 10 átomos de carbono, o un resto sulfoalquilo que contiene hasta 4 átomos de carbono. La Solicitud de Patente Japonesa N 5313304 (Fuji Photo Film Co. Ltd.) da a conocer un material fotográfico sensible con haluro de plata que incorpora un colorante que contiene múltiples grupos sulfonato y que está representado por la fórmula: 2   en la que R a y R b pueden ser restos alquil carboxilato o alquil sulfonato. Ninguno de los documentos de la técnica anterior da a conocer específicamente un colorante con cianina que tenga uno o más grupos ácido sulfónico o ácido fosfónico solubilizantes en agua unidos en la posición 3 del sistema de anillo de indolinio, en el que el colorante proporciona también al menos un grupo adecuado para dirigir el marcado covalente o no covalente de un materia diana. Se ha encontrado ahora que un nuevo tipo de reactivos de marcado con colorantes con cianina son útiles para marcar y detectar materiales biológicos y otros. Se ha encontrado que la presencia de uno, y preferiblemente de múltiples, grupos solubilizantes en agua unidos en la posición 3 del anillo de indolinio reduce las interacciones colorante-colorante, particularmente cuando múltiples moléculas de colorante están unidas a componentes tales como ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, etc. Como resultado, se minimiza la caída en la intensidad de la fluorescencia, que se asocia normalmente con múltiples componentes marcados y se debe al apilamiento colorantecolorante. De acuerdo con esto, en un primer aspecto, se proporciona un compuesto de fórmula (I): en la que: los grupos R 3 y R 4 están unidos a la estructura de anillo Z 1 y los grupos R 5 y R 6 están unidos a la estructura de anillo Z 2 y n = 1, 2 o 3. Z 1 y Z 2 representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un anillo, o un sistema de dos anillos aromáticos bifusionados; al menos uno de los grupos R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 y R 7 es el grupo E-F en el que E es un grupo separador que tiene una cadena de 1-20 átomos unidos seleccionados entre el grupo constituido por átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno y F es un grupo reactivo seleccionado entre éster de succinimidilo, éster de sulfo-succinimidilo, isotiocianato, maleimida, haloacetamida y fosforamidita; uno o más de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 que se seleccionan independientemente del grupo (CH2)k-W, en el que W es ácido sulfónico o ácido fosfónico y k es un entero de 1 a 10; cuando cualquiera de los grupos R 3 , R 4 , R 5 y R 6 no es dicho grupo E-F, dichos grupos restantes R 3 , R 4 , R 5 y R 6 se seleccionan independientemente entre hidrógeno y ácido sulfónico; cuando cualquiera de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 no es dicho grupo (CH2)k-W, dichos grupos restantes R 11 , R 12 , R 13 y R 14 son independientemente alquilo C1 C6; 3   los grupos R 7 restantes son hidrógeno o dos de R 7 junto con el grupo, forman un sistema de anillo de hidrocarburo que tiene 5 o 6 átomos. De manera adecuada, el compuesto de acuerdo con el primer aspecto incluye uno o más contraiones, que pueden ser positivos o negativos para equilibrar la carga (o cargas) formal del cromóforo del colorante. La naturaleza del contraión no es material de la invención y podría ser uno de muchos iones conocidos tales como NH4 + , K + , Na + , trifluoroacetato (F3C- CO2 - ), perclorato (ClO4 - ), Br - , o I - . En el contexto de la presente invención, deberá entenderse que los términos ácido sulfónico y ácido fosfónico incluirán también respectivamente los grupos sulfonato y fosfonato, debido a que son las formas ionizadas de los ácidos parentales. De manera adecuada, al menos dos de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 son el grupo (CH2)k-W. En una forma de realización preferida, uno de los grupos R 11 y R 12 , y uno de los grupos R 13 y R 14 , es el grupo (CH2)k-W, en el que W y k, son como se ha definido anteriormente en el presente documento. En estas formas de realización, los grupos restantes R 11 o R 12 y R 13 o R 14 son preferiblemente metilo. En las formas de realización preferidas, los compuestos de la presente invención son aquellos en los que W es ácido sulfónico. Preferiblemente k es 3 o 4. El (CH2)k-W particularmente preferido se ha seleccionado entre (CH2)3-SO3H y (CH2)4-SO3H. De manera adecuada, cuando cualquiera de los grupos R 1 y R 2 no es dicho grupo E-F, se pueden seleccionar dichos grupos restantes R 1 y R 2 entre alquilo C1 C6, bencilo tanto no sustituido como sustituido con ácido sulfónico, y el grupo (CH2)k-W, en el que W y k son como se ha definido anteriormente en el presente documento. Preferiblemente, dichos grupos restantes R 1 y R 2 se pueden seleccionar entre alquilo C1 C6, sulfobencilo y el grupo (CH2)k-W. Los grupos alquilo preferidos son metilo y etilo. En los colorantes de acuerdo con el primer aspecto, cuando se sustituye R 7 por el grupo E-F, se sustituye preferiblemente en la posición meso, por lo cual se entiende que el grupo R 7 central en la cadena de polimetina que se une a las estructuras del anillo heterocíclico puede estar sustituido con un grupo de unión diana. Cualquier grupo... [Seguir leyendo]

los grupos R 3 y R 4 están unidos a la estructura de anillo Z 1 y los grupos R 5 y R 6 están unidos a la estructura de anillo Z 2 y n = 1, 2 o 3. Z 1 y Z 2 representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un anillo, o un sistema de dos anillos aromáticos bifusionados; al menos uno de los grupos R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 y R 7 es el grupo E-F en el que E es un grupo separador que tiene una cadena de 1-20 átomos unidos seleccionados entre el grupo constituido por átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno y F es un grupo reactivo seleccionado entre éster de succinimidilo, éster de sulfo-succinimidilo, isotiocianato, maleimida, haloacetamida y fosforamidita; uno o más de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 que se seleccionan independientemente del grupo (CH2)k-W, en el que W es ácido sulfónico o ácido fosfónico y k es un entero de 1 a 10; cuando cualquiera de los grupos R 1 y R 2 no es dicho grupo E-F; dichos grupos R 1 y R 2 restantes se seleccionan independientemente entre alquilo C1 C6 , bencilo tanto no sustituido como sustituido con ácido sulfónico, y el grupo (CH2)k-W, en el que W y k son como se ha definido anteriormente en el presente documento; cuando cualquiera de los grupos R 3 , R 4 , R 5 y R 6 no es dicho grupo E-F, dichos grupos restantes R 3 , R 4 , R 5 y R 6 se seleccionan independientemente entre hidrógeno y ácido sulfónico; cuando cualquiera de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 no es dicho grupo (CH2)k-W, dichos grupos restantes R 11 , R 12 , R 13 y R 14 son independientemente alquilo C1 C6; los grupos restantes R 7 son hidrógeno o dos de R 7 junto con el grupo, forman un sistema de anillo de hidrocarburo que tiene 5 o 6 átomos. 2.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que al menos dos de R 11 , R 12 , R 13 y R 14 son independientemente (CH2)k-W, en el que W y k son como se ha definido anteriormente en el presente documento. 3.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que uno de los grupos R 11 y R 12 y uno de los grupos R 13 y R 14 es el grupo (CH2)k-W, en el que W y k son como se ha definido anteriormente en el presente documento; y los grupos R 11 o R 12 y R 13 o R 14 restantes son alquilo C1-C6. 4.- Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que W es ácido sulfónico. 27   5.- Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que (CH2)k-W se selecciona a partir de -(CH2)3-SO3H y -(CH2)4-SO3H. 6.- Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que Z 1 y Z 2 se seleccionan entre restos de fenilo y naftilo. 7.- Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho grupo separador E se selecciona entre: -(CHR)p-Q-(CHR)r- en el que Q se selecciona entre: -CHR-, -NR-, -O-, -CR=CR-, -Ar-, -C(O)-NR- y -C(O)-O-; R es hidrógeno o alquilo C1- C4, p es 0 - 5 y r es 1 -5. 8.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 en el que Q se selecciona entre: -CHR-, -C(O)-NH- y en la que R es como se ha definido anteriormente. 9.- Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho grupo E-F comprende un grupo carboxipentilo.. 10.- Un compuesto seleccionado entre: i) 2-{(1E,3E,5E)-5-[1-(5-carboxipentil)-3-metil-5-sulfo-3-(4-sulfobutil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]penta- 1,3-dienil}-1-etil-3-metil-3-(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato; ii) 2-{(1E,3E,5E)-5-[1-(5-carboxipentil)-3-metil-5-sulfo-3-(4-sulfobutil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]penta- 1,3-dienil}-3-metil-1,3-bis(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato; iii) 2-{(1E,3E,5E,7E)-7-[1-(5-carboxipentil)-3-metil-5-sulfo-3-(4-sulfobutil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno] hepta-1,3,5-trienil}-1-etil-3-metil-3-(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato; iv) 2-{(1E,3E,5E,7E)-7-[5-(carboximetil)-3-metil-1,3-bis(4-sulfobutil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]hepta- 1,3,5-trienil}-1-etil-3-metil-3-(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato; y v) 1-bencil)-2-{(1E,3E,5E)-5-[1-(5-carboxipentil)-3-metil-5-sulfo-3-(4-sulfobutil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno] penta-1,3-dienil}-3-metil-3-(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato. 11.- Un procedimiento para preparar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el procedimiento:. a) hacer reaccionar un primer compuesto intermedio que tiene la fórmula (A): en la que Z 1 , R 1 , R 3 , R 4 , R 11 y R 12 son como se ha definido anteriormente en el presente documento; 28   b) un segundo compuesto intermedio que puede ser igual o diferente del primer compuesto intermedio y que tiene la fórmula (B): en la que Z 2 , R 2 , R 5 , R 6 , R 13 y R 14 son como se ha definido anteriormente, y c) un tercer compuesto (C) adecuado para formar un enlace entre el primer y el segundo compuestos; con la condición que al menos uno de los grupos R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 y R 6 sea el grupo E-F, en el que E y F son como se ha definido en la reivindicación 1; y con la condición que uno o más de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 se seleccionan independientemente del grupo -(CH2)k-W, en el que W se selecciona entre grupos de ácido sulfónico y ácido fosfónico y k es un entero de 1 a 10. 12.- Un compuesto de fórmula: en la que: los grupos R 3 y R 4 se unen a la estructura del anillo Z 1 , en el que Z 1 se ha definido anteriormente en el presente documento; al menos uno de los grupos R 1 , R 3 y R 4 es el grupo E-F en el que E y F se definen como en la reivindicación 1; y al menos uno de los grupos R 11 y R 12 es el grupo -(CH2)k-W, en el que W se selecciona entre grupos de ácido sulfónico y ácido fosfónico y k es un entero entre 1 y 10. 13.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 en el que -(CH2)k-W se selecciona entre -(CH2)3-SO3H y - (CH2)4-SO3H. 14.- Un procedimiento para marcar un componente diana, comprendiendo el procedimiento: i) poner en contacto dicho componente con un compuesto de fórmula (I) 29   en la que: los grupos R 3 y R 4 se unen a la estructura del anillo Z 1 y los grupos R 5 y R 6 se unen a la estructura del anillo Z 2 , y n = 1, 2 o 3; Z 1 y Z 2 representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un anillo, o un sistema de anillo aromático bifusionado; al menos uno de los grupos R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 y R 7 es el grupo E-F en el que E y F son como se define en la reivindicación 1; uno o más de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 se seleccionan independientemente del grupo -(CH2)k-W, en el que W es ácido sulfónico o ácido fosfónico y k es un entero entre 1 y 10; cuando cualquiera de los grupos R 1 y R 2 no es dicho grupo E-F, dichos grupos R 1 y R 2 restantes se seleccionan independientemente entre alquilo C1 C6, bencilo, tanto no sustituido como sustituido con ácido sulfónico, y el grupo - (CH2)k-W, en el que W y k son como se ha definido anteriormente. cuando cualquiera de los grupos R 3 , R 4 , R 5 y R 6 no es dicho grupo E-F, dichos grupos R 3 , R 4 , R 5 y R 6 restantes se seleccionan independientemente entre hidrógeno y ácido sulfónico; cuando cualquiera de los grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 no es dicho grupo -(CH2)k-W, dichos grupos R 11 , R 12 , R 13 y R 14 restantes son independientemente alquilo C1 C6; los grupos R 7 restantes son hidrógeno o dos de R 7 junto con el grupo, forman un sistema de anillo hidrocarburo que tiene 5 o 6 átomos; e (ii) incubar dicho colorante fluorescente con dicho componente en condiciones adecuadas para la unión y por tanto, marcar dicho componente. 15.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 en el que dicho componente se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, lípido, proteína, péptido, carbohidrato, nucleótido, que contienen o se derivatizan para contener uno o más de un grupo amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo y tiofosfato, y ácido oxi o desoxipolinucleicos que contienen o se derivatizan para contener uno o más de un grupo amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo, carboxilo y tiofosfato, materiales microbianos, fármacos, hormonas, células, membranas celulares y toxinas.   31   32   33   34     36   37   38   39