Un procedimiento para purificar o enriquecer el FVIII de coagulación empleando cromatografía en una resina multimodal que tiene restos unidos a una matriz,

y siendo los restos capaces de interaccionar con FVIII en una mezcla mediante interacciones iónicas y otros tipos de interacciones, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

- proporcionar una fracción que contiene FVIII en una solución acuosa que tiene una alta fuerza iónica;

- poner en contacto la fracción que contiene FVIII con la resina multimodal;

- opcionalmente, lavar la resina multimodal que tiene el FVIII adsorbido con un tampón de lavado acuoso;

- eluir las fracciones que contienen FVIII mediante un tampón de elución acuoso formado por al menos un aminoácido que está cargado positivamente a pH 6 a 8, seleccionado de lisina, arginina, histidina y sus combinaciones; y

- opcionalmente, recoger las fracciones que contienen FVIII en forma purificada o enriquecida.

Un procedimiento para purificar el factor de coagulación VIII

La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar el factor de coagulación VIII (abreviado FVIII) y a una fracción que contiene FVIII que puede obtenerse mediante el procedimiento de la invención.

Antecedentes de la invención

La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que alteran la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación de la sangre. En su forma más habitual, la hemofilia A, hay una deficiencia en el factor de coagulación FVIII. La hemofilia A aparece en aproximadamente 1 de cada 5.000-10.000 nacimientos de niños varones. La proteína FVIII es un cofactor fundamental en la coagulación de la sangre con propiedades multifuncionales. La deficiencia en FVIII puede tratarse con concentrados derivados del plasma del FVIII o con FVIII producido de modo recombinante. El tratamiento con concentrados de FVIII ha conducido a una vida normalizada para los pacientes con hemofilia. Históricamente, la hemofilia A se ha tratado con FVIII procedente de plasma de sangre humana. En el plasma sanguíneo, bajo condiciones normales, la molécula de FVIII siempre está asociada con su cofactor, el factor de von Willebrandt (vWf) , que estabiliza la molécula de FVIII frente a diferentes formas de degradación.

Los productos de FVIII derivados del plasma aparecen en el mercado con diferentes purezas y con cantidades mayores o menores de vWf presentes. De modo habitual, los producos con baja cantidad de vWf contienen albúmina humana añadida y/u otros estabilizantes, incluyendo una mayor concentración de sales para estabilizar la molécula de FVIII. Los procedimientos usados para purificar el FVIII normalmente consistían en una combinación de diferentes procedimientos de precipitación, tales como la crioprecipitación, la precipitación con hidróxido de aluminio, etc., y etapas de cromatografía, principalmente etapas de intercambio iónico, de afinidad y de filtración en gel.

Para mejorar los productos de FVIII se ha empleado la cromatografía de afinidad, que elimina de modo eficaz los contaminantes hasta alcanzar un alto grado de pureza del FVIII, incluyendo la posibilidad de reducir también el vWf (Farrugia et al., Biotechnology and plasma fractionation industr y , The impact of advances in the production of coagulation FVIII, Biotechnology, vol. 3, nº 1, febrero de 1993) . La desventaja de la cromatografía de inmunoafinidad es que es relativamente cara, y que los anticuerpos monoclonales usados como ligandos de afinidad son de origen animal.

A mediados, se produjeron algunas transmisiones de virus asociadas a los productos de FVIII derivados de plasma. Aunque este problema se resolvió mediante el uso de etapas de reducción de virus específicas, este fue el punto de partida del desarrollo de productos de FVIII recombinantes (rFVIII) . En la década de los 90 se comercializó el primer producto de rFVIII y, hasta la fecha, existen tres productos de rFVIII diferentes (dos moléculas de longitud completa y una molécula con el dominio B delecionado en la que una parte inactiva de la molécula de FVIII se ha delecionado para aumentar la productividad de la célula hospedante (Eriksson et al., The manufacturing process for B-domain deleted recombinant FVIII, Seminars in Hematology, vol. 38, nº 2, supl. 4 (abril) , 20001: pp. 24-31) ) con un alto grado de pureza (todos sin vWf) .

Los procedimientos de purificación usados para purificar el rFVIII fueron una combinación de diferentes técnicas de cromatografía (ref. Bhattachar y ya et al., artículo de revista: Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies", CRIPS, vol.4, nº 3, julio-septiembre de 2003) . Una de ellas fue la técnica de inmunoafinidad conocida (aunque hay productos que resuelven esto, por ejemplo, con afinidad de péptidos (Kelly et al., Development and validation of an affinity chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of FVIII) ) o un fragmento de anticuerpo derivado de levadura (resina de afinidad de FVIII VIIISelect - GE HealthCare, nº de catálogo 17-5450, que actualmente está introduciéndose en el mercado) , tal como se usan para el FVIII plasmático.

Puesto que el vWf está ausente en todos los productos de rFVIII, deben tomarse ciertas medidas para estabilizar la molécula de FVIII frente a la pérdida de actividad (agregación, proteasas, adsorción superficial, etc.) . En uno de los productos se añade un agente quelante (EDTA, etc.) para proteger al FVIII frente a la degradación de metaloproteasas (documento US-A-5.831.026) . La adición de albúmina, aprotinina, insulina o incluso la coexpresión de FVIII con vWf (y eliminarlo posteriormente en el ciclo de purificación) son estrategias que se han realizado para aumentar la estabilidad de la molécula de rFVIII (ref. Bhattachar y ya et al., artículo de revisión: Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies", CRIPS, vol.4, nº 3, julio-septiembre de 2003) .

Otra estrategia (para mantener el procedimiento exento de agentes quelantes y aditivos de mamífero) se describe en el documento EP-A-1.707.634, en el que una combinación de cantidades mayores de sales contribuye a la estabilidad y la alta recuperación del producto de rFVIII (Wang et.al, Coagulation FVIII, structure and stability, International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003) , 1-15) . Sin embargo, esta técnica tiene ciertas desventajas.

Por ejemplo, el contenido de sales relativamente alto hace que no sea adecuado procesar directamente en un intercambiador iónico sin dilución (y la posible desestabilización, Parti et al., In vitro stability of recombinant FVIII, Haemophilia (2000) , 6, 513-522, Biotechnology and Bioengineering, vol. 87, nº 3, 5 de agosto, 2004) .

El documento WO-A-2009/007451 describe un procedimiento de purificación del FVIII que emplea una resina de modo mixto o multimodal. El procedimiento de purificación se basa en poner en contacto la proteína de FVIII con una resina de modo mixto o multimodal que contiene ligandos que comprenden una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente, y eluir dicha proteína de FVIII con un tampón de elución que contiene al menos 1, 5 M de sales y al menos el 40 % (en p/v) de etilenglicol, propilenglicol o sus mezclas, e iones de calcio.

El documento EP-A-1707634 describe un procedimiento para el aislamiento de proteínas producidas de modo recombinante, es decir, mediante diversos procedimientos tales como cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteínas, intercambio de tampones, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, medio de cromatografía de intercambio iónico/hidrófoba de modo mixto, cromatografía quelante, cromatografía de afinidad de carbohidratos, tales como lectina o heparina, cromatografía de exclusión molecular, electroforesis, diálisis, agentes de diferente precipitación, tales como polietilenglicol, sulfato de amonio, etanol, adsorción de hidroxiapatito, adsorción de membrana de filtración, ligandos acoplados a partículas magnéticas, etc. Sin embargo, identifica etapas de purificación cromatográfica particulares.

El documento WO-A-2005-082483 describe un procedimiento para la purificación de anticuerpos procedentes de una o más impurezas en un líquido, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho líquido con una primera resina de cromatografía formada por un soporte al cual se han inmovilizado ligandos multimodales para adsorber los anticuerpos a la resina, en el que cada ligando multimodal comprende al menos un grupo de intercambio catiónico y al menos un sistema de anillos aromáticos o heteroaromáticos. Se añade un eluyente para liberar los anticuerpos de la resina y el eluato se pone en contacto con una segunda resina de cromatografía.

El documento WO-A-2005/121.163 describe un procedimiento para el aislamiento de una o más proteínas a partir de una solución de proteínas. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una solución de proteínas que comprende una o más proteínas específicas y que tiene un pH preajustado y una fuerza iónica o conductividad preajustada, aplicar la solución de proteínas a una columna de lecho cargado o de lecho expandido que comprende un absorbente, y obtener una o más proteínas a partir de la columna, en el que la solución de proteínas se ha suplementado con un alcohol.

Descripción de la invención

Un objeto de la invención es evitar los... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para purificar o enriquecer el FVIII de coagulación empleando cromatografía en una resina multimodal que tiene restos unidos a una matriz, y siendo los restos capaces de interaccionar con FVIII en una mezcla mediante interacciones iónicas y otros tipos de interacciones, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

- proporcionar una fracción que contiene FVIII en una solución acuosa que tiene una alta fuerza iónica;

- poner en contacto la fracción que contiene FVIII con la resina multimodal;

- opcionalmente, lavar la resina multimodal que tiene el FVIII adsorbido con un tampón de lavado acuoso;

- eluir las fracciones que contienen FVIII mediante un tampón de elución acuoso formado por al menos un aminoácido que está cargado positivamente a pH 6 a 8, seleccionado de lisina, arginina, histidina y sus combinaciones; y

- opcionalmente, recoger las fracciones que contienen FVIII en forma purificada o enriquecida.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la resina multimodal comprende restos unidos a una matriz y los restos son capaces de interaccionar con FVIII en un entorno acuoso mediante interacciones iónicas y otros tipos de interacciones, tales como enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza porque el FVIII es FVIII recombinante, en particular FVIII con el dominio B delecionado.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, que se caracteriza porque la solución acuosa comprende FVIII en una solución con un alto contenido de sales que se corresponde con una conductividad de aproximadamente 25 a aproximadamente 200 mS/cm a 25 ºC.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, que se caracteriza porque está presente lisina, arginina o histidina en concentraciones > 0, 4 M, en particular > 0, 5 M.

6. El procedimiento de las reivindicación 5, que se caracteriza porque el tampón de elución comprende además compuestos orgánicos que contienen al menos un grupo hidroxilo, tales como un alcohol, compuestos orgánicos que contienen al menos un grupo amino, tales como un aminoácido, al menos una fuente que proporciona iones Ca2+, al menos un compuesto para regular la fuerza iónica del tampón, tal como sales inorgánicas, al menos un detergente no iónico, y al menos una sustancia tamponante para regular el pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, en particular a aproximadamente un valor neutro.

7. El procedimiento de las reivindicación 6, que se caracteriza porque el alcohol se selecciona del grupo que consiste en metanol, propanol, etilenglicol y propilenglicol; la fuente que proporciona Ca2+ es CaCl2; las sales inorgánicas se seleccionan del grupo que consiste en KCl y NaCl; el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en Tween 20, Tween 80 y Pluronic F68; la sustancia tamponante se selecciona del grupo que consiste en citrato de sodio, histidina, HEPES, MES y acetato de sodio a un pH entre 6-8.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, que se caracteriza porque el tampón de lavado se aplica a la resina multimodal para arrastrar los contaminantes y conservar el FVIII, antes de liberar el FVIII.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se caracteriza porque la resina de

cromatografía “multimodal” contiene al menos uno de los siguientes restos:

a. un ligando de N-bencil-N-metiletanolamina cargado positivamente,

b. un ligando de ácido 2- (benzoilamino) butanoico cargado negativamente,

c. un ligando de fenilpropilo,

d. un ligando de N-hexilo,

e. un ligando de 4-mercaptoetilpiridina,

f. un ligando de ácido 3- ( (3-metil-5- ( (tetrahidrofuran-2-ilmetil) amino) fenil) amino) benzoico, o cualquiera de sus combinaciones.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que se caracteriza porque la resina de

cromatografía “multimodal” se selecciona de las siguientes resinas disponibles en el mercado: HEP Hypercel™; PPA Hypercel™ ; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que se caracteriza porque la etapa de cromatografía multimodal se combina con una etapa de cromatografía de afinidad de FVIII en la que la afinidad es proporcionada por un ligando a base de una proteína expresada en levaduras.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se caracteriza porque la secuencia de purificación comprende además etapas de inactivación/eliminación de patógenos que comprenden una etapa de inactivación basada en procesos químicos, una etapa de eliminación basada en el tamaño, etapas cromatográficas

o cualquiera de sus combinaciones, basándose dichas etapas en diferentes propiedades fisiológicas dirigidas al patógeno que se va a eliminar.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se caracteriza porque la secuencia de purificación comprende además las siguientes etapas:

i. una membrana aniónica, tal como Sartobind Q, en particular para la reducción del ADN;

ii. una resina multimodal catiónica, tal como Capto MMC;

iii. una resina de intercambio catiónico, tal como SP Sepharose FF;

iv. una membrana aniónica, tal como Sartobind Q, en particular para una reducción adicional del ADN;

v. una etapa de inactivación basada en procesos químicos para los virus con envuelta lipídica, en particular la inactivación con disolvente/detergente empleando fosfato de tri-n-butilo y Triton X-100;

vi. una resina de afinidad a base de un ligando de proteína, tal como VIIISelect, consistiendo el ligando de VIIISelect en un fragmento de anticuerpo expresado en levaduras, o una resina de cromatografía multimodal aniónica, tal como Capto Adhere;

vii. una etapa de eliminación de patógenos mediante filtración con un tamaño medio de poro de aproximadamente 20 nm, tal como Planova 20N;

viii. una resina de intercambio aniónico, tal como Q Sepharose FF;

ix. una resina de cromatografía de exclusión molecular, tal como Superdex 200pg.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, que se caracteriza porque las condiciones de elución para FVIII de la etapa de intercambio catiónico se basan en Ca, la concentración varía de 0, 15-0, 25 M y la conductividad total del tampón de elución no es mayor que 25 mS/cm a 25 ºC.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 y/o 14, que se caracteriza porque la pureza después de la última etapa de purificación es > 4.000 UI/mg, preferiblemente > 9.000 UI/mg, y más preferiblemente >10.000 UI/mg de proteína, y porque en contenido de ADN es < 1.000pg/1.000 UI de FVIII, preferiblemente <1 00pg/1.000 UI de FVIII.

Apéndice 1

Suspensión celular (2-3e7 células/ml)

Salado

Separación de células

Reducción del ADN (membrana-Q)

Etapa de captura (Capto MMC)

SP Sepharose FF

Reducción del ADN (membrana-Q)

Tratamiento S/D

Ligando de afinidad de VIIISelect

Q-Sepharose FF

GF-eluato

Apéndice 2

Suspensión celular (2-3e7 células/ml)

Salado

Separación de células

Reducción del ADN (membrana-Q)

Etapa de captura (Capto MMC)

Reducción del ADN (membrana-Q)

SP Sepharose FF

Tratamiento S/D

Capto Adhere

Q-Sepharose FF

GF-eluato

Apéndice 3

Suspensión celular (2-3e7 células/ml)

Salado

Separación de células

Reducción del ADN (membrana-Q)

Etapa de captura (Capto MMC)

SP Sepharose FF

Reducción del ADN (membrana-Q)

Tratamiento S/D

Ligando de afinidad de VIIISelect Capto Adhere

Q-Sepharose FF Q-Sepharose FF

GF-eluato GF-eluato