PROTEÍNAS DE METALOPROTEASA.

Esta invención se refiere a proteínas nuevas, denominadas INSP005a e INSP005b, identificadas en la presente memoria como proteínas secretadas, en particular miembros de la familia de metaloproteasas, y al uso de estas proteínas y secuencias de ácidos nucleicos de los genes codificantes en el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades. Antecedentes El proceso de descubrimiento de fármacos está experimentando en la actualidad una revolución fundamental, ya que la era de la genómica funcional ha alcanzado la mayoría de edad. La expresión "genómica funcional" se aplica a una aproximación que utiliza herramientas bioinformáticas para asignar una función a secuencias proteicas de interés. Tales herramientas se están haciendo cada vez más necesarias, ya que la velocidad de generación de datos de secuencias está dejando atrás rápidamente la capacidad de los laboratorios de investigación de asignar funciones a estas secuencias proteicas. A medida que las herramientas bioinformáticas incrementan su potencia y su exactitud, estas herramientas están sustituyendo rápidamente a las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. De hecho, las herramientas bioinformáticas avanzadas usadas en la identificación de la presente invención son capaces ya de producir resultados a los que se puede otorgar un grado elevado de confianza. Diversas instituciones y organizaciones comerciales están examinando datos de secuencias a medida que aparecen, y se están realizando descubrimientos significativos continuamente. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad continua de identificar y caracterizar más genes y los polipéptidos que codifican, como objetivos para la investigación y para el descubrimiento de fármacos. Antecedentes de las proteínas secretadas La capacidad de que las células produzcan y secreten proteínas extracelulares es fundamental para muchos procesos biológicos. Las células secretan enzimas, factores de crecimiento, proteínas de la matriz extracelular y moléculas de señalización. Esto se da a través de la fusión de una vesícula secretora con la membrana plasmática. En la mayoría de los casos, pero no en todos, las proteínas se dirigen al retículo endoplásmico y a las vesículas secretoras mediante un péptido señal. Los péptidos señal son secuencias que actúan en cis que afectan al transporte de las cadenas polipeptídicas desde el citoplasma hacia un compartimento asociado a la membrana, tal como una vesícula secretora. Los polipéptidos que se dirigen a las vesículas secretoras se secretan a la matriz extracelular o se retienen en la membrana plasmática. Los polipéptidos que se retienen en la membrana plasmática tendrán uno o más dominios transmembrana. Los ejemplos de proteínas secretadas que desempeñan un papel fundamental en el funcionamiento de una célula son las citocinas, hormonas, proteínas de la matriz extracelular (moléculas de adhesión), proteasas, y factores de crecimiento y diferenciación. A continuación se da una descripción de algunas de las propiedades de estas proteínas. Las proteasas son enzimas que hidrolizan de manera irreversible enlaces amida en péptidos y proteínas. Las proteasas están ampliamente distribuidas, y están implicadas en muchos procesos biológicos diferentes, desde la acti- vación de proteínas y péptidos hasta la degradación de proteínas. A pesar del hecho de que se ha demostrado que las proteasas están implicadas en muchas enfermedades diferentes, los fármacos dirigidos hacia las proteasas todavía son escasos en farmacia, aunque los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE) han estado entre los fármacos antihipertensivos más eficaces durante varios años. Las proteasas han recibido recientemente una publicidad considerable como objetivos terapéuticos valiosos tras la aprobación de los inhibidores de la proteasa de VIH. Las proteasas se pueden dividir en grandes Familias. El término "Familia" se usa para describir un grupo de proteasas en que cada miembro muestra una relación evolutiva hacia al menos otro miembro, a lo largo de toda la secuencia o al menos en parte de la secuencia responsable de la actividad catalítica. El nombre de cada Familia refleja el tipo de actividad catalítica de las proteasas de la Familia. Así, las serín proteasas pertenecen a la familia S, las treo- nín proteasas pertenecen a la familia T, las aspartil proteasas pertenecen a la familia A, las cisteín proteasas pertenecen a la familia C y las metaloproteinasas pertenecen a la familia M. Las metaloproteasas y las Serín proteasas se hallan habitualmente en la matriz extracelular. Metaloproteasas (Familia M): Las metaloproteasas se pueden dividir en 2 grupos principales dependiendo de la presencia o ausencia de un motivo de unión de Zinc (HEXXH). 2   1.1 Presencia del motivo HEXXH (22 familias): Número de Prosite: PDOC00129 Familias con miembros interesantes: M2: Peptidil-dipeptidasa A (Enzima Conversora de Angiotensina I: ACE) M13: Neprilisina (Encefalinasa A=endopeptidasa neutra=NEP), enzima conversora de endotelina (ECE) M10B: Matrixina (Metaloproteasas de la Matriz=MMPs) M12B: Reprolisina (ADAM-10; ADAM-17 = enzima conversora de TNF-alfa = TACE)/Desintegrina (otras proteasas ADAM). Las ADAMs son una familia de proteínas grande, expresadas de manera generalizada y reguladas durante el desarrollo con múltiples funciones potenciales en las interacciones célula-célula y célula-matriz. Entre ellas, TACE representa un nuevo objetivo emergente para la artritis. M41: Esta familia contiene metaloproteasas dependientes de ATP: FtsH, proteínas del proteosoma. Uno de los mayores grupos de metaloproteinasas terapéuticamente interesantes es la familia de Metaloproteinasas de la matriz (MMPs). Las metaloproteinasas de la matriz son una familia de enzimas que contienen zinc que son responsables de la remodelación de la matriz extracelular en todo el cuerpo. Se ha demostrado que están implicadas en el cáncer (incremento de la invasividad, efectos sobre los vasos sanguíneos nuevos), y en la artritis (implicación en la degradación del cartílago (Dahlberg, L., et al., Arthritis Rheum. 2000 43(3):673-82) y también la conversión de TNF-alfa (Hanemaaijer, R., et al., J Biol Chem. 1997 272(50):31504-9, Shlopov, B. V., et al., Arthritis Rheum. 1997 40(11):2065-74)). De hecho, se ha demostrado que diferentes MMPs se sobreexpresan en enfermedades tales como artritis (Seitz, M., et al., Rheumatology (Oxford). 2000 39(6):637-645, Yoshihara, Y., et al., Ann Rheum Dis. 2000 59(6):455-61, Yamanaka, H., et al., Lab Invest. 2000 80(5):677-87, Jovanovic, D. V., et al., Arthritis Rheum. mayo de 2000; 43(5):1134-44, Ribbens, C., et al., J Rheumatol. 2000 27(4):888-93) y el cáncer (Sakamoto, Y., et al., Int J Oncol. 2000 17(2):237-43, Kerkela, E., et al., J Invest Dermatol. 2000 114(6):1113-9, Fang, J., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 97(8):3884-9, Sun, Y., et al., J Biol Chem. 2000 275(15):11327-32, McCawley, L. J., et al., Mol Med Today. 2000 6(4):149-56, Ara, T., et al., J Pediatr Surg. 2000 35(3):432-7, Shigemasa, K., et al., Med Oncol. 2000 17(1):52-8, Nakanishi, K., et al., Hum Pathol. 2000 31(2):193-200, Dalberg, K., et al., World J Surg. 2000 24(3):334-40). Se han propuesto los inhibidores de estas enzimas como agentes terapéuticos potenciales para el uso en el tratamiento del cáncer y la artritis. Más recientemente, se ha demostrado que los MMPs también pueden tener un papel en la liberación de receptores solubles de citocinas, factores de crecimiento y otros mediadores celulares, lo que sugiere que los inhibidores selectivos de MMPs pueden tener aplicaciones terapéuticas más amplias que las propuestas previamente. Las MMPs se han dividido en 4 familias basándose en las homologías de las secuencias de aminoácidos de su estructura de dominios, aparte de la región catalítica. Familia de dominio mínimo: matrilisina (PUMP-1, MMP-7) escinde proteoglicano, laminina y fibronectina. Familia de dominio de hemopexina: Colagenasas: capacidad única de escindir colágeno fibrilar. El papel de las colagenasas en la degradación del cartílago las hace objetivos atractivos para el tratamiento de la artritis reumatoide y osteoartritis. colagenasa de fibroblastos (colagenasa intersticial, MMP-1) colagenasa de neutrófilos (MMP-8) colagenasa-3 (MMP-13) Metaloelastasa: MME (MMP-12) Stromelisina-1 (MMP-3), 2 (MMP-10) y 3 (MMP-11). MMP-11 se excreta en forma activa y su función podría ser activar otras MMPs. Familia de dominio de fibronectina: degrada un gran número de sustratos de la matriz (gelatina, elastina, colágeno de tipo IV) Gelatinasa A (MMP-2); además de su implicación en el cáncer (invasividad tumoral), se ha propuesto como un objetivo potencial para el descubrimiento de agentes antiplaquetarios, ya que puede desempeñar un papel importante en la activación de las plaquetas.... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que tiene actividad de metaloproteasa que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº:34 o SEQ ID Nº:36. 2. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido según la reivindicación 1. 3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que dicha proteína comprende un marcador de histidina. 4. Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 5. Una molécula de ácido nucleico purificada según la reivindicación 4, que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº:33 o SEQ ID Nº:35. 6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se indicó en la reivindicación 4 o la reivindicación 5. 7. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 6. 8. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 9. El anticuerpo de la reivindicación 8 que inhibe la actividad de metaloproteasa de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 10. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, un vector según la reivindicación 6, una célula hospedadora según la reivindicación 7, o un anticuerpo según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, para el uso de la terapia o el diagnóstico de una enfermedad, y en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática viral o aguda, que incluye insuficiencia hepática alcohólica, o una enfermedad inflamatoria. 11. Un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende determinar in vitro el nivel de expresión de un gen natural que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o determinar la actividad de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en un tejido de dicho paciente y compa- rar dicho nivel de expresión o actividad con un nivel de control, en el que un nivel que es diferente de dicho nivel de control es indicativo de la enfermedad, y en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática viral o aguda, que incluye insuficiencia hepática alcohólica, o una enfermedad inflamatoria. 12. Un método según la reivindicación 11, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo según la reivindicación 8 o la reivindicación 9 con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-polipéptido; y (b) detectar dicho complejo. 13. Un método según la reivindicación 11, que comprende las etapas de: a. poner en contacto una muestra de tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico en condicio- nes rigurosas que permiten la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nu- cleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 y la sonda; b. poner en contacto una muestra de control con dicha sonda en las mismas condiciones usadas en la etapa a); y c. detectar la presencia de los complejos híbridos en dichas muestras; en el que la detección de niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra de control es indicativa de la enfermedad. 14. Un método según la reivindicación 11, que comprende: a. poner en contacto una muestra de ácido nucleico de tejido del paciente con un cebador de ácido nu- cleico en condiciones rigurosas que permiten la formación de un complejo híbrido entre una molé- cula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 y el cebador; b. poner en contacto una muestra de control con dicho cebador en las mismas condiciones usadas en la etapa a); y c. amplificar el ácido nucleico de la muestra; y d. detectar el nivel de ácido nucleico amplificado a partir de las muestras del paciente y del control; en el que la detección de niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra del paciente que difieren significativamente de los niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra de control es indicativa de la enfermedad. 15. El uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como una metaloproteasa. 42   16. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, un vector según la reivindicación 6, una célula hospedadora según la reivindicación 7, o un anticuerpo según la reivindicación 8 o la reivindicación 9. 17. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, un vector según la reivindicación 6, una célula hospedadora según la reivindicación 7, un anticuerpo según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, o una composición farmacéutica según la reivindicación 16, para el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática viral o aguda, que incluye insuficiencia hepática alcohólica, o una enfermedad inflamatoria. 18. Un método para monitorizar el tratamiento terapéutico de una enfermedad en un paciente ex vivo, que comprende monitorizar a lo largo de un periodo de tiempo el nivel de expresión o actividad de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico según la reivindica- ción 4 o la reivindicación 5 en un tejido de dicho paciente, en el que la alteración de dicho nivel de expresión o actividad a lo largo del periodo de tiempo hacia un nivel de control es indicativa de la regresión de dicha enfermedad, y en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática viral o aguda, que incluye insuficiencia hepática alcohólica, o una enfermedad inflamatoria. 19. Un método para la identificación de un compuesto que es eficaz en el tratamiento y/o el diagnóstico de una enfermedad, que comprende poner en contacto un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 con uno o más compuestos que se sospecha que poseen afinidad de unión por dicho polipéptido o molécula de ácido nucleico, y seleccionar un compuesto que se une específicamente a dicha molécula de ácido nucleico o polipéptido, en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática viral o aguda, que incluye insuficiencia hepática alcohólica, o una enfermedad inflamatoria. 43   FIGURA 1 Blastp frente a NCBI-nr 1/18 >dbj|BAB68513.1| enzima de eclosión EHE4 [Anguilla japonica] Longitud = 271 Puntuación = 197 bits (502), Esperado = 1e-49 Identidades = 103/233 (44%), Positivos = 141/233 (60%), Huecos = 5/233 (2%) Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Tblastn frente a NCBI-est Tejido = Tumor de útero >gb|BI061462.1|BI061462 IL3-UT0117-070301-494-H12 UT0117 cADN de Homo sapiens. Longitud = 652 Puntuación = 175 bits (443), Esperado = 2e-42 Identidades = 85/86 (98%), Positivos = 85/86 (98%) Marco = -2 Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: 44   FIGURA 2 2/18 Biblioteca Fuente tisular/celular Vector Cepa hospedadora Proveedor Nº de cat. 1 cerebro fetal humano Zap II XL1-Blue MRF' Stratagene 936206 2 ovario humano GT10 LE392 Clontech HL1098a 3 hipófisis humana GT10 LE392 Clontech HL1097a 4 placenta humana GT11 LE392 Clontech HL1075b 5 testículo humano GT11 LE392 Clontech HL1010b 6 sustancia negra humana GT10 LE392 interno 7 cerebro fetal humano GT10 LE392 interno 8 corteza cerebral humana GT10 LE392 interno 9 colon humano GT10 LE392 Clontech HL1034a 10 cerebro fetal humano GT10 LE392 Clontech HL1065a 11 pulmón fetal humano GT10 LE392 Clontech HL1072a 12 riñón fetal humano GT10 LE392 Clontech HL1071a 13 hígado fetal humano GT10 LE392 Clontech HL1064a 14 médula ósea humana GT10 LE392 Clontech HL1058a monocitos de sangre periférica humana GT10 LE392 Clontech HL1050a 16 placenta humana GT10 LE392 interno 17 SHSYSY humano GT10 LE392 interno 18 línea celular U373 humana GT10 LE392 interno 19 línea celular CFPoc-I humana Uni Zap XL1-Blue MRF' Stratagene 936206 20 retina humana GT10 LE392 Clontech HL1132a 21 vejiga urinaria humana GT10 LE392 interno 22 plaquetas humanas Uni Zap XL1-Blue MRF' interno 23 neuroblastoma humano Kan + TS GT10 LE392 interno 24 músculo liso bronquial humano GT10 LE392 interno 25 músculo liso bronquial humano GT10 LE392 interno 26 timo humano GT10 LE392 Clontech HL1127a 27 tramo de 5' de bazo humano GT11 LE392 Clontech HL1134b 28 monocitos de sangre periférica humana GT10 LE392 Clontech HL1050a 29 testículo humano GT10 LE392 Clontech HL1065a 30 cerebro fetal humano GT10 LE392 Clontech HL1065a 31 sustancia negra humana GT10 LE392 Clontech HL1093a 32 placenta humana nº 11 GT11 LE392 Clontech HL1075b 33 cerebro fetal humano GT10 LE392 Clontech por encargo 34 placenta humana nº 59 GT10 LE392 Clontech HL5014a 35 hipófisis humana GT10 LE392 Clontech HL1097a 36 páncreas humano nº 63 Uni Zap XR XL1-Blue MRF' Stratagene 937208 37 placenta humana nº 19 GT11 LE392 Clontech HL1008 38 tramo de 5' de hígado humano GT11 LE392 Clontech HL1115b 39 útero humano Zap-CMV XR XL1-Blue MRF' Stratagene 980207 biblioteca de cADN de insertos grandes de riñón humano TriplEx2 XL1-Blue Clontech HL5507u   FIGURA 3 Posición y sentido de los cebadores de PCR 46   FIGURA 4 Cebador Nombre Secuencia (5'-3') 47   FIGURA 5 Codón de parada Sitio de poliadenilación consenso 48   FIGURA 6 Cebador Secuencia (5'-3') 49   FIGURA 7   FIGURA 8 Búsqueda= INSP005a (336 letras) 8/18 Base de datos: Todas las traducciones no superfluas de GenBank CDS+PDB+SwissProt+PIR+PRF 1.247.039 secuencias; 397.579.747 letras totales Buscando..................................................hecho Puntuación Valor Secuencias que producen alineaciones significativas: (bits) E ref|XP_141346.1| similar a la enzima de eclosión EHE7 [Anguilla japon... 416 e-115 dbj|BAB68518.1 enzima de eclosión EHE13 [Anguilla japonica] 187 2e-46 dbj|BAB68515.1 enzima de eclosión EHE7 [Anguilla japonica] 186 4e-46 dbj|BAB68516.1 enzima de eclosión EHE10 [Anguilla japonica] 186 4e-46 dbj|BAB68513.1 enzima de eclosión EHE4 [Anguilla japonica] 186 5e-46 dbj|BAB68517.1 enzima de eclosión EHE12 [Anguilla japonica] 183 3e-45 dbj|BAB68514.1 enzima de eclosión EHE6 [Anguilla japonica] 183 3e-45 dbj|BAB68519.1 enzima de eclosión EHE14 [Anguilla japonica] 182 7e-45 pir|C48826 proteinasa de eclosión sumamente coriolítica (EC 3.4.24.-) H... 171 le-41 dbj|BAA12146.1| coriolisina H [Oryzias latipes] 171 2e-41 Alineación máxima respecto de la metaloproteinasa conocida: >dbj|BAB68518.1| enzima de eclosión EHE13 [Anguilla japonica] Longitud = 271 Puntuación = 187 bits (475), Esperado = 2e-46 Identidades = 93/183 (50%), Positivos = 124/183 (66%), Huecos = 3/183 (1%) Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: 51   FIGURA 9 9/18 Molécula: pCR4 TOPO-IPAAA78836-1, ADN Circular de 5005 bps Nombre de Archivo: 13164.cm5, fecha 24 de oct. de 2002 Descripción: Ligadura de producto de PCR invertido de 78836_F2/R8 en el vector* lineal pCR4-TOPO Características de la molécula: Tipo Inicio Fin Nombre Descripción REGIÓN 205 221 M13 sitio de cebado rev MARCADOR 243 T3 REGIÓN 262 294 Poliligador' REGIÓN 294 294 sitio de clonación TOPO' GEN 1315 308 C IPAAA78836-1 REGIÓN 1342 295 C producto de PCR insertado REGIÓN 1343 1360 'Poliligador REGIÓN 1343 1343 'sitio de clonación TOPO MARCADOR 1395 C T7 REGIÓN 1403 1418 M13 GEN 2207 3001 KanR GEN 3205 4065 AmpR REGIÓN 4210 4883 pUC ori 52   FIGURA 10 53   54   FIGURA 11 Búsqueda= INSP005b (431 letras) 12/18 Base de datos: Todas las traducciones no superfluas de GenBank CDS+PDB+SwissProt+PIR+PRF 1.247.039 secuencias; 397.579.747 letras totales Buscando.................................................. hecho Puntuación Valor Secuencias que producen alineaciones significativas: (bits) E ref|XP_141346.1| similar a la enzima de eclosión EHE7 [Anguilla japon... 540 e-152 dbj|BAB68513.1| enzima de eclosión EHE4 [Anguilla japonica] 198 1e-49 dbj|BAB68518.1| enzima de eclosión EHE13 [Anguilla japonica] 198 1e-49 dbj|BAB68516.1| enzima de eclosión EHE10 [Anguilla japonica) 197 3e-49 dbj|BAB68515.1| enzima de eclosión EHE7 [Anguilla japonica] 196 4e-49 dbj|BAB68514.1| enzima de eclosión EHE6 [Anguilla japonica] 196 7e-49 dbj|BAB68517.11 enzima de eclosión EHE12 [Anguilla japonica] 194 3e-48 dbj|BAB68519.1| enzima de eclosión EHE14 [Anguilla japonica] 191 1e-47 pir||C48826 proteinasa de eclosión sumamente coriolítica (EC 3.4.24.-) H... 187 3e-46 dbj|BAA12146.1| coriolisina H [Oryzias latipes] 186 4e-46 Alineación máxima respecto de la metaloproteinasa conocida: >dbj|BAB68518.1| enzima de eclosión EHE13 [Anguilla japonica] Longitud = 271 Puntuación = 198 bits (503), Esperado = le-49 Identidades = 103/233 (44%), Positivos = 144/233 (61%), Huecos = 5/233 (2%) Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo: Problema: Objetivo:   FIGURA 12 13/18 Molécula: pCR4 TOPO-IPAAA78836-2, ADN Circular de 5269 pbs Nombre de Archivo: 13296.cm5, fecha 24 de Oct de 2002 Descripción: Ligadura de IPAAA78836v2 invertido en el vector* lineal pCR4-TOPO Características de la molécula: Tipo Inicio Fin Nombre Descripción REGIÓN 205 221 M13 sitio de cebado rev MARCADOR 243 T3 REGIÓN 262 294 Poliligador' REGIÓN 294 294 sitio de clonación TOPO' GEN 1600 307 C IPAAA78836-2 REGIÓN 1607 1624 'Poliligador REGIÓN 1607 1607 'sitio de clonación TOPO MARCADOR 1659 C T7 REGIÓN 1667 1682 M13 GEN 2471 3265 KanR GEN 3469 4329 AmpR REGIÓN 4474 5147 pUC ori 56   FIGURA 13 Los residuos del sitio activo se destacan en gris a continuación. PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 57   PREDIC. DE INSP005 PREDIC. DE INSP005 58   FIGURA 14 Resultado SignalP-NN: Puntuación # datos >INSP005b longitud = 70 # Medida Posición Valor Umbral péptido señal? max. C 24 1,000 0,33 SI max. Y 24 0,789 0,32 SI max. S 13 0,991 0,82 SI mean S 1-23 0,929 0,47 SI # Sitio de escisión más probable entre pos. 23 y 24: ILG-AP Puntuación #datos Predicción SignalP-NN (redes euk): INSP005b Posición Posición >INSP005b Predicción: Péptido señal Probabilidad de péptido señal: 0,996 Probabilidad de anclaje señal: 0,003 Probabilidad de sitio de escisión máx.: 0,302 entre la pos. 23 y 24 59 Puntuación C Puntuación S Puntuación Y Resultado SignalP-HMM: Predicción SignalP-NN (redes euk): INSP005b Prob. de escisión Prob. de región n Prob. de región h Prob. de región c   FIGURA 15A FIGURA 15B ASAT (8 h) ALAT (8 h)   FIGURA 16A FIGURA 16B 61