Método diagnóstico in vitro para la identificación de un trastorno proliferativo,

que comprende detectar la presencia o la expresión de un polipéptido o molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 que presenta una de las secuencias mostradas en las figuras 20 y 21.

Proteína de replicación Ciz1.

La presente invención se refiere a un método de cribado para la identificación de agentes que modulan la actividad de una proteína de replicación del ADN como diana para la intervención en la terapia del cáncer, e incluye agentes que modulan dicha actividad.

Asimismo, la invención se refiere a la utilización de la proteína de replicación del ADN, y los transcritos de ARN del mismo en la prognosis y el diagnóstico de las enfermedades proliferativas, por ejemplo el cáncer.

Introducción

El inicio de la replicación del ADN es uno de los principales puntos de control del ciclo celular en los mamíferos, además del punto de acción de muchos productos génicos que se encuentran desregulados en el cáncer (Hanahan y Weinberg, 2000) . El proceso de inicio implica el ensamblaje de proteínas del complejo de prerreplicación, que incluye las proteínas Cdc6, Cdt1 y Mcm del complejo de reconocimiento de origen (ORC) , en los orígenes de replicación durante la etapa G1 del ciclo celular. A continuación, actúa un segundo grupo de proteínas que facilita la carga de las ADN polimerasas y de sus factores accesorios, incluyendo el PCNA, y la transición a la etapa S. El proceso de inicio se encuentra regulado por la proteína quinasa 2 dependiente de ciclina (Cdk2) , Cdc7-dbf4 y el inhibidor de Cdt1 llamado geminina (para una revisión ver Bell y Dutta, 2002) . En el núcleo de las células en etapa S, las horquillas de replicación se agrupan formando cientos de "focos" o fábricas de replicación (Cook, 1999) . Las fábricas de replicación se unen aparentemente a un marco estructural dentro del núcleo; sin embargo, la naturaleza de las moléculas que forman la unión y su papel en la actividad de las horquillas de replicación sigue sin conocerse con exactitud.

La identificación de las proteínas implicadas en la replicación del ADN eucariótico y el análisis de las rutas básicas que regulan su actividad durante el ciclo celular ha sido impulsada principalmente por la genética de las levaduras. Estas proteínas y rutas generalmente se encuentran conservadas en levaduras y ser humano. Sin embargo, en organismos multicelulares, que se diferencian a lo largo de diversas rutas de desarrollo, se están descubriendo capas adicionales de complejidad. Por ejemplo, en vertebrados, varias proteínas implicadas en la diferenciación neuronal también regulan la transición de fases G1 a S (Ohnuma et al., 2001) . Comprenden el inhibidor de Cdk p21CIP1/WAF1/SDI1, que está implicado en la diferenciación de los oligodendrocitos tras la detención del crecimiento (Zezula et al., 2001) y en la diferenciación terminal de otros tipos celulares (Parker et al., 1995) .

El inicio de la replicación del ADN puede reconstituirse in vitro con núcleos aislados y extractos citosólicos procedentes de células de mamífero (Krude, 2000; Krude et al., 1997; Laman et al., 2001; Stoeber et al., 1998) . Además, utilizando Cdk2 recombinante acomplejado con las ciclinas E o A, pueden reconstituirse independientemente el ensamblaje del complejo de replicación y la activación de la síntesis del ADN (Coverley et al., 2002) . Se ha estudiado la etapa de activación, catalizada in vitro por ciclina A-cdk2, y han demostrado que una proteína relativamente no estudiada, la proteína de dedo de cinc de interacción con p21-Cip1 (Ciz1) funciona durante la etapa del proceso de inicio. La Ciz1 humana fue identificada anteriormente utilizando una modificación del cribado de dos híbridos de levadura con ciclina E-p21, y el análisis bioquímico corroboró la existencia de una interacción con p21 (Mitsui et al., 1999) . Se propuso, aunque no demostró, un papel potencial en la transcripción, y no se atribuyó ninguna otra función a Ciz1. Más recientemente, se ha aislado el gen Ciz1 a partir de una biblioteca de ADNc derivada de meduloblastoma humano utilizando un modelo de tumorigénesis in vivo (Warder y Keherly, 2003) . El análisis de los presentes inventores demuestra por primera vez que Ciz1 ejerce una función positiva en el inicio de la replicación del ADN.

Se produce una serie de cambios en las proteínas unidas a la cromatina al activarse la síntesis de AND in vitro con ciclina A-cdk2 recombinante. La presente invención se refiere al resultado de que un antígeno relacionado con cdc6, p85, se correlaciona con el inicio de la replicación del ADN y de que se encuentra regulado por la ciclina A-cdk2. La proteína ha sido clonada a partir de una biblioteca embrionaria de ratón y ha sido identificada como Ciz1 de ratón.

El análisis in vitro ha demostrado que la proteína Ciz1 regula positivamente el inicio de la replicación del ADN y que su actividad se encuentra modulada por la fosforilación de cdk en la treonina 191/2, ligándola a las rutas dependientes de cdk que controlan el inicio. La forma embrionaria de Ciz1 de ratón es procesada alternativamente, en contraste con las formas predichas y somáticas. La Ciz1 humana también se procesa alternativamente, con variabilidad en los mismos exones que la Ciz1 de ratón. Se ha encontrado que la forma embrionaria recombinante de Ciz1 estimula el inicio de la replicación del ADN de mamífero y que los cánceres pediátricos expresan formas "de tipo embrionario" de Ciz1. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se propone que el corte y empalme erróneo de Ciz1 produce formas de tipo embrionario de Ciz1 en tiempos inadecuados del desarrollo. Esto estimula la replicación incorrectamente regulada del ADN y contribuye a la formación o avance de linajes de células de cáncer.

Se han desarrollado varias técnicas en los últimos años que pretenden eliminar específicamente genes y/o productos génicos. Por ejemplo, la utilización de moléculas de ácidos nucleicos antisentido para unirse y de esta manera bloquear o inactivar moléculas de ARNm diana es un medio efectivo para inhibir la producción de productos génicos.

Una técnica mucho más reciente para eliminar específicamente la función génica es la introducción de ARN de doble cadena, también denominado ARN inhibidor (ARNi) , en una célula, resultando en la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de ARNi. La molécula de ARNi comprende dos cadenas complementarias de ARN (una cadena de sentido y una cadena antisentido) hibridadas entre sí formando una molécula de ARN de doble cadena. La molécula de ARNi típicamente deriva de la secuencia exónica o codificante del gen que debe anularse.

Tanto los ácidos nucleicos como las proteínas presentan una estructura de secuencia lineal, definida por su secuencia de bases o de aminoácidos, y también una estructura tridimensional que en parte está determinada por la secuencia lineal y también el ambiente en el que se localizan dichas moléculas. Las moléculas terapéuticas convencionales son moléculas de tamaño reducido, por ejemplo péptidos, polipéptidos o anticuerpos, que se unen a moléculas diana, produciendo un efecto agonista o antagonista. Se ha puesto de manifiesto que las moléculas de ácidos nucleicos también presentan un potencial con respecto a la provisión de agentes con las propiedades de unión necesarias que podrían presentar utilidad terapéutica. Estas moléculas de ácidos nucleicos típicamente se denominan aptámeros. Los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos pequeñas, habitualmente estabilizadas, que comprenden un dominio de unión para una molécula diana.

Los aptámeros pueden comprender por lo menos una base nucleótida modificada. La expresión "base nucleótida modificada" comprende nucleótidos con una base y/o azúcar modificado covalentemente. Por ejemplo, entre los nucleótidos modificados se incluyen nucleótidos que presentan azúcares que se unen covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes de un grupo hidroxilo en la posición 3' y diferentes de un grupo fosfato en la posición 5'. De esta manera, los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares 2'-sustituidos, tales como 2'-O-metilo, 2-O-alquilo, 2-O-alilo, 2'-S-alquilo, 2'-S-alilo, 2'-fluoro, 2'-halo o 2-azido-ribosa, análogos carbocíclicos de azúcares, azúcares a-anómericos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa y sedoheptulosa.

Los nucleótidos modificados son conocidos de la técnica y comprenden, a título de ejemplo no limitativo, purinas y/o pirimidinas alquiladas, purinas y/o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Estas clases de pirimidinas y purinas son conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen pseudoisocitosina, N4,... [Seguir leyendo]

1. Método diagnóstico in vitro para la identificación de un trastorno proliferativo, que comprende detectar la presencia o la expresión de un polipéptido o molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 que presenta una de las secuencias mostradas en las figuras 20 y 21.

2. Método diagnóstico según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las etapas siguientes:

(i) poner en contacto una muestra aislada de un sujeto que debe someterse a ensayo con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido Ciz1 según la reivindicación 1; y

(ii) detectar o medir la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido Ciz1 en dicha muestra.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "Exón 4 ausente" mostrada en la figura 20A.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "variante sin exón 14" mostrada en la figura 20B.

5. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "variante sin exón 4 ni parcialmente exón 6" mostrada en la figura 20B.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21B.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21G.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21H.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho trastorno proliferativo es el cáncer.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es un cáncer pediátrico seleccionado de entre el grupo constituido por retinoblastoma, neuroblastoma, linfoma de Burkitt, meduloblastoma y tumores de la familia del sarcoma de Ewings.

12. Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es carcinoma, adenocarcinoma, linfoma o leucemia.

13. Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es cáncer hepático, pulmonar o de la piel.