PROTEÍNA DE FUSIÓN DE TRANSCRIPTASA INVERSA DE LA TELOMERASA, NUCLEÓTIDOS QUE LA CODIFICAN Y USOS DE LA MISMA.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de una proteína de fusión de hTERT-LTB como se expone en la SEC ID Nº: 6.

Proteína de fusión de transcriptasa inversa de la telomerasa, nucleótidos que la codifican y usos de la misma Campo de la invención La presente invención se refiere en general a la terapia del cáncer. Más específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican proteínas de fusión, en la que las proteínas de fusión comprenden al menos una porción del polipéptido asociado a tumores transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) . La presente invención también proporciona vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos, proteínas de fusión purificadas y procedimientos para generar o aumentar una respuesta inmune contra el producto proteico del gen de TERT, usando las composiciones y moléculas desveladas en el presente documento.

Antecedentes de la invención La vacunación se ha convertido en un procedimiento convencional para la prevención de numerosas enfermedades infecciosas. La aplicación de vacunas a otras enfermedades, tales como cáncer, es ahora una posibilidad atractiva debido a los avances en la ingeniería molecular y a una mejor comprensión de la inmunología tumoral.

El cáncer es una de las causas principales de mortalidad en todo el mundo. A pesar de la abundancia de investigaciones relacionadas con el cáncer, las terapias convencionales que combinan cirugía, radiación y quimioterapia con frecuencia fracasan en el tratamiento eficaz de cánceres establecidos. Continúan sin estar disponibles también procedimientos fiables de prevención.

El cáncer implica normalmente el mal funcionamiento de genes que contribuyen a la regulación del ciclo celular o a la proliferación celular, tales como factores de crecimiento y sus receptores, oncogenes y genes supresores de tumores. Los productos de muchos de estos genes se expresan en la superficie de una amplia diversidad de células tumorales y, por lo tanto, se denominan antígenos asociados o tumores (TAA) . Se ha demostrado que la introducción de genes que codifican TAA directamente en un sujeto genera una respuesta inmune protectora frente a los TAA en muchos modelos experimentales, haciendo de estas moléculas una diana para la terapia vacunal. Sin embargo, debido a que muchos de estos productos génicos también se expresan en células normales, aunque a menores niveles, muchas terapias inmunológicas que se dirigen a TAA han demostrado ser ineficaces debido a la autotolerancia.

Los genes que codifican varios antígenos asociados a tumores (TAA) se han aislado, caracterizado e insertado en vectores genéticos tales como ADN plasmídico y vectores víricos. Un antígeno asociado a tumor que se ha implicado en la patogénesis del cáncer es la telomerasa (TERT) .

La telomerasa es una ADN polimerasa que funciona normalmente en el mantenimiento de la longitud del telómero en los extremos de los cromosomas. Durante el crecimiento celular normal, un cebador de ARN se une al extremo 5' del ADN e inicia la replicación. Tras la eliminación del cebador de ARN, se introduce un hueco de longitud en la cadena de ADN hija resultante. Por lo tanto, la replicación de una cadena lineal de ADN con polimerasas convencionales conduce a un acortamiento de la longitud del telómero en cada ronda progresiva de replicación. Dicho acortamiento de la longitud del telómero es responsable de la senescencia celular o del envejecimiento de las células somáticas humanas normales.

La telomerasa es una ribonucleoproteína que comprende un componente de ARN y un componente proteico catalítico (transcriptasa inversa de la telomerasa) . El componente catalítico de la telomerasa humana lo describieron Meyerson y col. (Cell 1197: 785-95 (1990) y Nakamura y col. (Science 277: 955-59 (1997) ) . La enzima TERT usa su componente de ARN como molde para la síntesis de ADN de telómero, permitiendo de este modo que los telómeros mantengan su longitud a lo largo de generaciones sucesivas de crecimiento celular. Dicho mantenimiento de la longitud del telómero a lo largo de numerosos ciclos proliferativos permite que una célula escape a la senescencia normal y se vuelva inmortal, permitiendo que un tumor crezca y metastatice a lo largo de grandes periodos de tiempo. Debido a que la telomerasa confiere inmortalidad replicativa a las células, se ha detectado actividad telomerasa en líneas de células cancerosas y en una variedad diversa de tipos tumorales (Kim y col. Science 266: 2011-15 (1994) ) . Por el contrario, la telomerasa es inactiva o solamente se expresa de forma transitoria a bajos niveles en tejidos humanos normales y cultivos de células somáticas normales. La combinación de la sobreexpresión de telomerasa en la mayoría de tipos de cáncer, así como la baja expresión o la ausencia de expresión en células normales, hace de TERT una diana para la terapia y/o profilaxis de enfermedades asociadas con una proliferación celular aberrante tales como cáncer.

El desarrollo de una vacuna específica de telomerasa es ahora posible debido a que los componentes catalíticos y de ARN de la telomerasa se han clonado y caracterizado (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.166.178) . Sin embargo, el desarrollo y la comercialización de muchas vacunas se han visto obstaculizados por las dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión del inmunógeno deseado en organismos huésped transformados con éxito. El desarrollo de vacunas basadas en ADN eficaces también se ha visto obstaculizado por la incapacidad para generar una respuesta inmune de una magnitud suficiente en individuos tratados para conducir a la regresión tumoral en un entorno clínico. Por lo tanto, a pesar de la identificación de las secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican las proteínas telomerasa descritas anteriormente, sería altamente deseable desarrollar una vacuna que sea capaz de generar una respuesta inmune específica de TERT aumentada respecto a un ADNc de TERT de longitud completa de tipo silvestre, cuando se administre a un mamífero. También sería deseable desarrollar procedimientos para tratar o prevenir cánceres asociados a TERT que utilicen moléculas de ácido nucleico o proteínas que potencien eficazmente y con seguridad una respuesta inmune específica de TERT.

Sumario de la invención Como se ha indicado anteriormente, la expresión del gen del antígeno asociado a tumor transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) está comúnmente asociada con el desarrollo o la presencia de adenocarcinomas, incluyendo carcinomas colorrectales. Con este fin, la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para generar o aumentar la inmunidad contra los productos proteicos expresados por el gen de TERT humano (hTERT) . En concreto, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican la variante de proteínas de fusión, en la que las proteínas de fusión comprenden la proteína hTERT fusionada a una porción sustancial de la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) expuesta en la SEC ID Nº : 6. La presente invención también proporciona vectores recombinantes, incluyendo, pero sin limitación, vectores plasmídicos y adenovirus, que comprenden dichos polinucleótidos, y células huésped que comprenden dichos vectores recombinantes. También se proporcionan en el presente documento proteínas de fusión purificadas codificadas por polinucleótidos de la invención. Las proteínas de fusión de hTERT-LTB y polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión son útiles como vacunas para la prevención y/o tratamiento del cáncer asociado a la telomerasa. Dichas vacunas son útiles como monoterapia o como parte de un régimen terapéutico, comprendiendo dicho régimen la administración de una segunda vacuna, tal como una vacuna de polinucleótido, basada en células, de proteína o basada en péptido, o comprendiendo radioterapia o quimioterapia.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica hTERT y/o la secuencia de nucleótidos que codifica LTB comprende codones que se han optimizado para altos niveles de expresión en una célula huésped humana. En otras palabras, en ciertas realizaciones de la invención, el patrón de uso de codones de la secuencia polinucleotídica se parece al de genes mamíferos y/o seres humanos altamente expresados.

Otro aspecto de la presente invención es una construcción de expresión que comprende nucleótidos que codifican la proteína hTERT-LTB variante expuesta en la SEC ID Nº : 6. En realizaciones preferidas de esta parte de la invención, la construcción comprende una secuencia líder TPA antes de la secuencia codificante para... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de una proteína de fusión de hTERT-LTB como se expone en la SEC ID Nº : 6.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia como se expone en la SEC ID Nº : 5.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende además una secuencia líder que codifica la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia como se expone en la SEC ID Nº : 1.

5. Una proteína de fusión de hTERT-LTB purificada, que comprende mutaciones que funcionan eliminando la actividad catalítica de la telomerasa, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº : 6.

6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que el vector es un vector plasmídico o un vector de adenovirus.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende un casete de expresión que comprende la proteína de fusión de hTERT y un promotor unido operativamente al polinucleótido.

9. El vector de la reivindicación 7 u 8, en el que el vector es el plásmido pV1J.

10. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6, 7, 8 ó 9.

11. Un vector de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que es un vector Ad5 o Ad6.

12. Un procedimiento para expresar una proteína de fusión de hTERT-LTB en una célula huésped recombinante, que comprende:

(a) introducir un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una célula huésped adecuada; y

(b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de fusión de hTERT-LTB.

13. Una composición farmacéutica que comprende un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 u 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una combinación de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un vector adenovírico de acuerdo con la reivindicación 11, en la que los vectores no son los mismos.

15. Una molécula de ácido nucleico, un vector o una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11, para su uso en el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.

16. Una molécula de ácido nucleico, un vector o una proteína para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el uso es el tratamiento del cáncer.

17. Uso de una molécula de ácido nucleico, o un vector o una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.