Promotores múltiples y su uso para la expresión de genes.

Bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión,

en cuyo caso el casete de expresión comprende en dirección 5' -3' un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II:

5' -P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3' (II)

Donde

n representa un valor de número entero de 0 a 10,

Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico enlazante;

P1, Px y Py codifican secuencias de promotores iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes, que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa de ARN;

y al menos Py comprende un segmento de secuencia terminal 3' que facilita el enlace ribosómico, G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está enlazada funcionalmente con la secuencia regulatoria ubicada corriente arriba de 5'.

Promotores múltiples y su uso para la expresión de genes La presente invención se refiere a una bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión en dirección 5' - 3' 5 comprende un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II:

5' -P1- (-Ax-Px-) n-Ay-Py-G-3' (II)

donde n representa un valor de número entero de 0 a 10, Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico - enlazadora;

P1, Px y Py representan secuencias promotoras iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa-ARN; y al menos Py comprende un segmento de secuencia 3' -terminal, que interviene en el enlace de ribosoma, G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está conectada funcionalmente con la secuencia regulatoria situada 5' - corriente arriba;

así como a procesos para la preparación de productos biosintéticos mediante el cultivo de la bacteria corineforme genéticamente modificada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Diferentes productos biosintéticos se preparan mediante procesos metabólicos naturales en las células y se usan en muchas ramas de la industria, incluida la industria de productos alimenticios, de forrajes y piensos, de cosméticos, de comida para animales y alimento para humanos. Estas sustancias, que se denominan en conjunto como productos de la química fina / proteínas, comprenden, entre otros, ácidos orgánicos tanto aminoácidos proteinogénicos como también no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como proteínas y enzimas. Su producción se efectúa a gran escala de la manera más conveniente por medio del cultivo de cepas de bacterias o de otros microorganismos que se desarrollaron para producir y secretar grandes cantidades de la sustancia deseada. Para este propósito organismos particularmente adecuados son bacterias corineformes, bacterias gram positivas no patógenas.

Es conocido que pueden producirse aminoácidos mediante fermentación de cepas de bacterias corineformes, principalmente Cor y nebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia se trabaja permanentemente en el 30 mejoramiento de los métodos de producción. Los mejoramientos del método pueden referirse a medidas industriales de fermentación, como por ejemplo agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios de nutrición como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el procesamiento para elaborar un producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico aunque también secamiento por pulverización, o las propiedades de desempeño intrínsecas del microorganismo mismo.

Desde hace unos años se emplean igualmente métodos de la tecnología de ADN recombinante para el mejoramiento de cepas de Cor y nebacterium que producen productos de química fina/proteínas, amplificando genes individuales e investigando el efecto en la producción de productos de química fina / proteínas.

Otras formas para desarrollar un método para la producción de productos de química fina o proteínas o para elevar o mejorar la productividad de un método ya existente para la producción de productos de química fina o proteínas comprenden el incremento o la modificación de la expresión de uno o varios genes y/o la influencia de la traducción de un ARNm mediante secuencias adecuadas de polinucleótidos. La influencia puede comprender en este contexto el incremento, la reducción o también otros parámetros de la expresión de los genes, como patrón temporal de expresión.

El experto en la materia conoce diferentes componentes de secuencias de regulación bacterianas. Se distinguen los 45 puntos de enlace de reguladores, llamados también operadores, los puntos de enlace de ARN-polimerasaholoenzimas, también llamadas regiones 35 y 10, y el sitio de enlace de ARN 16S ribosómico, también llamado sitio de enlace ribosómico (RBS) o llamado también secuencia Shine-Dalgarno.

En la bibliografía (E. coli y S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press) se describe que tanto la composición de la secuencia de polinucleótido de la secuencia Shine-Dalgarno, la sucesión de secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótido que está contenida en la secuencia Shine-Dalgarno hasta el codón de inicio, tienen una influencia esencial en la velocidad de la traducción.

Las secuencias de ácido nucleico con actividad de promotor pueden influir de manera diferente la formación de ARNm. Los promotores cuyas actividades son independientes de la fase fisiológica de crecimiento del organismo se llaman constitutivos. Otros promotores a su vez reaccionan a estímulos externos químicos y físicos, como oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. A su vez, otros muestran en diferentes fases de crecimiento una fuerte dependencia de su actividad. Por ejemplo, en la bibliografía se describen promotores que muestran una actividad particularmente pronunciada durante la fase de crecimiento exponencial de los microorganismos, aunque también en la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia favorable en la productividad para una producción de productos de química fina y proteínas, según la ruta metabólica.

En especies de Cor y nebacterium podían aislarse ya aquellas secuencias que pueden utilizarse para un incremento o un debilitamiento de la expresión génica. Estos promotores regulados pueden incrementar o reducir la velocidad con la que un gen se transcribe, independientemente de las condiciones internas y/o externas de la célula. La presencia de un factor determinado, conocido como inductor, puede estimular en parte la velocidad de la transcripción del promotor. Los inductores puede influenciar directa, pero también indirectamente, la transcripción del promotor. Otra clase de factores conocidos como supresores está en capacidad de reducir, pero también de inhibir, la transcripción, del promotor. Tal como los inductores también, los supresores también pueden actuar directa o indirectamente. Sin embargo, también se conocen promotores que se regulan mediante la temperatura. De esta manera el nivel de transcripción de tales promotores puede elevarse o atenuarse elevando la temperatura de crecimiento por encima de la temperatura normal de crecimiento de la célula.

Hasta el día de hoy se ha descrito una cantidad baja de promotores de C. Glutamicum. El promotor del gen de malato-sintasa de C. Glutamicum se describió en DE-A- 44 40 118. Este promotor se inserta corriente arriba de un gen estructural que codifica una proteína. Después de la transformación de una estructura así en una bacteria corineforme, se regula la expresión del gen estructural insertado corriente abajo del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto se adiciona al medio un inductor correspondiente.

Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) han descrito una fusión de transcripción entre el promotor pta-ack de C. glutamicum y un gen reportero (cloramfenicol acetiltransferasa) . Las células de C. Glutamicum que contienen una fusión de transcripción así, tienen una expresión elevada del gen reportero al crecer en medio que contiene acetato. Al compararse con éstas, las células transformadas que crecían en glucosa no mostraron expresión incrementada de este gen reportero.

En Patek et al., Microbiology 142:1297 (1996) se describieron algunas secuencias de ADN a partir de C. glutamicum, las cuales pueden reforzar la expresión de de un gen reportero en células de C. glutamicum. Estas secuencias se compararon entre sí para definir secuencias de consenso para promotores de C. Glutamicum.

Otras secuencias de ADN de C. glutamicum, las cuales pueden utilizarse para la regulación de la expresión génica se habían descrito en la WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados representan unidades de expresión de cor y nebacterium glutamicum, las cuales pueden utilizarse o bien para el incremento o, no obstante, para la reducción de una expresión de gen. Además, en este documento se describen plásmidos recombinantes en los que se asocian las unidades de expresión de cor y nebacterium glutamicum con genes heterólogos. Los métodos aquí descritos, la fusión de un... [Seguir leyendo]

1. Bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión comprende en dirección 5' -3' un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II:

5' -P1- (-Ax-Px-) n-Ay-Py-G-3' (II)

Donde n representa un valor de número entero de 0 a 10, Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico enlazante; P1, Px y Py codifican secuencias de promotores iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes, que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa de ARN; y al menos Py comprende un segmento de secuencia terminal 3' que facilita el enlace ribosómico, G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está enlazada funcionalmente con la secuencia regulatoria ubicada corriente arriba de 5'.

2. Bacteria corineforme genéticamente modificada según la reivindicación 1, en cuyo caso las bacterias corineformes son bacterias del género cor y nebacterium o brevibacterium.

3. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 o 2, que contiene al menos un casete de expresión en forma integrada.

4. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 3, en cuyo caso P1, Px y Py presentan una identidad hacia la secuencia de partida de al menos 80% o son secuencias de promotores artificiales.

5. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 4, en cuyo caso P1, Px y Py se derivan respectivamente de una secuencia continua de 35 a 500 residuos de nucleótido, la cual se encuentra en el genoma del organismos corriente arriba de 5' de la secuencia que codifica una proteína y presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia de partida.

6. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 5, en cuyo caso P1, Px y Py se seleccionan independientemente entre sí entre las secuencias de promotores para la secuencia codificante de una proteína con alta abundancia en un organismo.

7. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 6, en cuyo caso P1, Px y Py independientemente entre sí se selecciona entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.

8. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 7, en cuyo caso los promotores se seleccionan entre promotores fuertes, constitutivos o regulables.

9. Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1-8, en cuyo caso G se selecciona entre

a. ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía biosintética aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos,

b. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos,

c. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos,

d. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos,

e. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de dioles,

f. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de carbohidratos,

g. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos,

h. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de vitaminas,

i. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de cofactores y

j. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de enzimas.

k. ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir del metabolismo central.

10. Bacteria corineforme genéticamente modificada, según la reivindicación 9a) en cuyo caso los ácidos nucleicos que codifican proteínas de la vía biosintética, seleccionadas entre cinasa de aspartato, aspartato-semialdehídodeshidrogenasa, diaminopimelato-deshidrogenasa, diaminopimelato-descarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinatos-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato-cinasa, piruvatocarboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, malato-quinona-oxidoreductasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolatoreductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadeshidrogenasa, homoserina-cinasa, treonina-sintasa, exportador-portador de treonina, treonina-deshidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa l, cisteína-sintasa II, metionina - sintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910-R, arginilARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína treonina Efflux, serinahidroximetiltransferasa, fructosa-1, 6afosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa, 6-fosfofrutocinasa, tetrahidropicolinatosuccinilasa, succinilo-aminocetopimelato-aminotransferasa, succinil-diaminopimelato-desuccinilasa, diaminopimelato-epimerasa, 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, glucosafosfato-isomerasa, fosfoglicerato-mutasa, enolasa, piruvato-cinasa, aspartato-transaminasa, y malato-enzima.

11. Método para producir un producto biosintético, en cuyo caso se cultiva una bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 10 y se aísla del cultivo el producto deseado.

12. Método según la reivindicación 11, en cuyo caso el producto biosintético se selecciona entre ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas.

Figura 1