Promotores con una eficiencia de transcripción modificada derivdos de la levadura metilotrófica Hansenula polymorpha.

ADN, que comprende al menos una secuencia de promotor que se deriva de un promotor de tipo silvestre de Hansenula polymorfa,

el cual se selecciona del grupo compuesto por el promotor MOX, FMD y TPS1, caracterizado porque la eficiencia de transcripción de esta secuencia de promotor se modula modificando un sitio de enlace de ADN en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre, en cuyo caso la modificación se efectúa mediante palindromización de al menos una de las secuencias de ADN según las SEQ ID No: 1-4, 11, 13, 16 y 20, en cuyo caso la secuencia palindromizada se desvía en no más de 2 bases por cadena de una secuencia completamente palindromizada.

Promotores con una eficiencia de transcripción modificada derivados de la levadura metilotrófica Hansenula Polymorpha La presente invención se refiere a un ácido desoxirribonucleico (ADN) , que comprende al menos una secuencia de promotor que se deriva de un promotor de tipo silvestre de una levadura metilotrófica, cuya eficiencia de transcripción se modula en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre. Además, la presente invención se refiere a células huéspedes, vectores de expresión, kits y métodos para producir proteínas usando el ADN de la invención así como diferentes usos de los mismos y a un método para la preparación de vectores de expresión.

Hongos y, principalmente, levaduras representan sistemas atractivos para la producción de proteínas recombinantes debido a su capacidad para la modificación co-y post-translacional de proteínas, la cual es similar a la de los mamíferos. Para la preparación de proteínas recombinantes muchas veces se expresa la secuencia codificante de un gen para una proteína de interés bajo el control de un promotor heterólogo adecuado. En tal caso, los promotores inducibles de levaduras metilotróficas han demostrado ser particularmente ventajosos.

Las levaduras metilotróficas comprenden los géneros Candida, Hansenula, Pichia y Torulopsis. Sus promotores se caracterizan por una inducción de transcripción extraordinariamente fuerte así como por una regulabilidad buena y sencilla. Promotores particularmente sencillos son los promotores in vivo responsables por la regulación del metabolismo de metanol. Las levaduras metilotróficas catalizan la oxidación de metanol a través de las etapas intermedias del formaldehído y del formiato hacia el dióxido de carbono, en cuyo caso estas reacciones se catalizan respectivamente por una alcohol-o metanoloxidasa (Aoxp o Moxp) , una formaldehído-dehidrogenasa (Fmdp) y una formiato-dehidrogenasa (Fmdhp) . El peróxido de hidrógeno que surge en el primer paso se degrada por la catalasa. El compuesto de C1 se asimila mediante reacción de transcetolasa de xilulosa-5 (P) con formaldehído. Esta reacción se cataliza mediante la dihidroxiacetona (Dhasp) . Las enzimas Aoxp o Moxp, Fmdhp y Dhasp expresadas bajo el control de los promotores AOX o MOX, FMD y DHAS representan en las células inducidas por metanol hasta el 40% de toda la proteína de la célula. En los círculos especializados estos promotores se denominan, por lo tanto, como superpromotores. La mayoría de los promotores para los genes mencionados son reprimibles mediante glucosa y, por lo tanto, son muy bien regulables de forma individual.

Otro promotor muy fuerte derivado de levaduras metilotróficas es el promotor TPS1, el cual controla la expresión del gen de trehalosa-6-fosfato-sintasa y es inducible por calor. Tps1p cataliza la reacción de glucosa-6-fosfato (GLU6P) y UDP-glucosa (UDPG) hasta trehalosa-6-fosfato y UDP. Las células de levadura tratadas acumulan trehalosa durante un choque término de una hora de 27º C a 40º C y desarrollan de esta manera una tolerancia al calor elevada.

Las levaduras metilotróficas tienen además promotores constitutivos extraordinariamente fuertes. Dos de estos promotores constitutivos muy fuertes son GAPDH (glicerina-aldehído-fosfato-dehidrogenasa) y PMA1 (H+-ATPasa 1 enlazada a la membrana de plasma) .

En la representación recombinante de proteínas heterólogas, tanto la actividad de la secuencia de promotor, su regulación como también su integración al genoma de una célula huésped adecuada, determinan la viabilidad económica y la eficiencia del proceso. En general es deseable una actividad de transcripción particularmente alta. Aunque en algunos casos una actividad de transcripción demasiado alta puede conducir a que se dañe o muera la célula huésped, antes que hayan podido introducirse todos los productos génicos heterólogos de la modificación coy post-translacional necesaria para la actividad. Principalmente, la cantidad de proteínas tóxicas deben regularse de tal modo que el efecto tóxico se minimice hasta el rendimiento óptimo de las proteínas transcritas y modificadas de modo post-translacional. Una regulación así también es difícil de efectuar con los promotores conocidos, inducibles mediante metanol.

Por lo tanto, es objetivo de la presente invención proporcionar un ADN que comprende una secuencia promotora, el cual satisface los requisitos de sistemas de transcripción de levadura metilotróficos.

Según la invención este objetivo se logra mediante un ADN tal como se define en la reivindicación 1.

Se estableció que los promotores MOX, FMD y TPS1 derivados de Hansenula polymoría pueden modularse en su eficiencia de transcripción. Una modulación así de la eficiencia de transcripción puede llevarse a cabo tanto mediante el refuerzo como también mediante la reducción de la actividad de la secuencia promotora y/o integración multiplicada o reducida de la secuencia promotora al genoma de una célula huésped adecuada.

Por un promotor de tipo silvestre de una levadura metilotrófica ha de entenderse un promotor tal que tiene la misma secuencia de ADN y la misma eficiencia de transcripción que los promotores derivados de una levadura metilotrófica de procedencia natural. El experto en la materia conoce promotores de tipo silvestre adecuados a partir de la literatura especializada, mediante depósito público y mediante divulgación en bancos de datos. De esta manera, por ejemplo, se han divulgado los promotores FMD, MOX y TPS1 en las solicitudes de patente europeas EP299108, EP173378 y EP1151112.

Ejemplos de secuencias de determinados promotores FMD, MOX y TPS1 de tipo silvestre pueden tomarse de las figuras 4 a 6. Puesto que el análisis secuencial era algunas veces deficiente, principalmente hace diez y hace más de veinte años, pero los posibles errores son reconocibles mediante verificación por medio de métodos rutinarios estandarizados, por promotores de tipo silvestre en el contexto de la invención se entienden no solo los promotores de tipo silvestre divulgados en el estado de la técnica por medio de una descripción, sino también los promotores de tipo silvestre accesibles realmente.

Por eficiencia de transcripción ha de entenderse la producción de transcripto, es decir ARNm por unidad de tiempo. Para el propósito de esta solicitud se determina como la cantidad de una proteína heteróloga que se expresa en una célula huésped adecuada bajo el control de un promotor por unidad de tiempo, en cuyo caso se supone que la eficiencia de translación depende solo de la cantidad de transcripto disponible. La eficiencia de transcripción se determina, por ejemplo, determinando la cantidad de la proteína heteróloga o evaluando las señales de un gen reportero como lacZ o fitasa en diferentes momentos de tiempo mediante métodos estándar.

Particularmente se prefiere un ADN de acuerdo con la invención en el que la eficiencia de la transcripción de la secuencia promotora se incrementa en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre insertando un sitio de enlace de ADN. En una forma de realización las secuencias de ADN de la invención tienen incluso una eficiencia de transcripción considerablemente elevada frente a los promotores de tipo silvestre. Esto es tanto más sorprendente por cuanto los promotores de tipo silvestre de las levaduras metilotróficas ya se cuentan entre los promotores más eficientes de todos. Un incremento más y, sobre todo, tan ostensible es por lo tanto supremamente asombroso.

En una forma preferida de realización la invención se refiere a un ADN cuya secuencia promotora en comparación con el promotor de tipo silvestre tiene una eficiencia de transcripción incrementada por al menos el factor 1, 5, preferiblemente por al menos el factor 2, particularmente preferible por al menos el factor 2, 5.

En otra forma preferida de realización, la invención se refiere a un ADN cuya secuencia promotora tiene una eficiencia de transcripción disminuida en comparación con el promotor de tipo silvestre preferentemente en al menos el factor 0, 5.

Las secuencias promotoras de un ADN de acuerdo con la invención se derivan de un promotor derivado del género Hansenula polymoría.

La secuencia promotora de un ADN de la invención se deriva de promotores del grupo de MOX, FMD y TPS1.

Preferentemente, un ADN de acuerdo con la invención comprende al menos una secuencia promotora que se deriva de un promotor de tipo silvestre mediante la inserción, deleción y/o el intercambio... [Seguir leyendo]

1. ADN, que comprende al menos una secuencia de promotor que se deriva de un promotor de tipo silvestre de Hansenula polymoría, el cual se selecciona del grupo compuesto por el promotor MOX, FMD y TPS1, caracterizado porque la eficiencia de transcripción de esta secuencia de promotor se modula modificando un sitio de enlace de ADN en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre, en cuyo caso la modificación se efectúa mediante palindromización de al menos una de las secuencias de ADN según las SEQ ID No: 1-4, 11, 13, 16 y 20, en cuyo caso la secuencia palindromizada se desvía en no más de 2 bases por cadena de una secuencia completamente palindromizada.

2. ADN según la reivindicación 1, caracterizado porque la eficiencia de transcripción de la secuencia promotora se eleva en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre.

3. ADN según la reivindicación 1, caracterizado porque la eficiencia de transcripción de la secuencia promotora en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre se eleva en al menos el factor 1, 5, preferentemente en al menos el factor 2, particularmente preferible en al menos el factor 2, 5.

4. ADN según la reivindicación 1, caracterizado porque la eficiencia de transcripción de la secuencia promotora se reduce en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestre, se reduce preferentemente en al menos el factor 0, 5.

5. ADN según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia de promotor se deriva de un promotor de tipo silvestre mediante inserción, deleción y/o el intercambio de al menos una base, preferentemente mediante el intercambio de una o dos bases.

6. ADN según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia palindromizada es simétrica o asimétrica, preferentemente simétrica y se desvía en solo una base y particularmente preferible no se desvía absolutamente de una secuencia completamente palindrómica.

7. ADN según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además al menos una secuencia de ADN que se encuentra bajo el control de transcripción de la secuencia del promotor para un gen homólogo y/o heterólogo.

8. ADN según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además una secuencia de ADN que codifica para una señal de secreción.

9. ADN según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la señal de secreción se selecciona del grupo de GAM, GAM-kex2, CHH-kex2, MFa-prepro y la señal de secreción de lisozima de pollo.

10. Célula huésped, caracterizada porque la célula huésped contiene al menos un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada porque el ADN se integra al genoma de la célula huésped o se presenta como molécula de ADN extracromosómica, preferentemente episómica, en la célula huésped.

12. Célula huésped según una de las reivindicaciones 10 o 11, caracterizada porque la célula huésped es una célula de levadura, preferentemente una célula de levadura metilotrófica, particularmente preferible una célula de levadura de los géneros Candida, Torulopsis, Hansenula o Pichia, particularmente preferible Hansenula polymoría.

13. Vector de expresión, preferentemente un plásmido, caracterizado porque el vector comprende un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Vector de expresión según la reivindicación 13, caracterizado porque el vector contiene el gen de fitasa o lacZ como marco de lectura reportero.

15. Kit que comprende:

(a) un vector de expresión según la reivindicación 13 o 14, el cual es adecuado para clonar un ADN, el cual codifica una proteína recombinante, y

(b) una célula huésped para producir la proteína recombinante.

16. Uso de un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9 o de una célula huésped según una de las reivindicaciones 10 a 12 o de un vector de expresión según la reivindicación 13 o 14 o de un kit según la reivindicación 15 para la expresión de un gen.

17. Uso de un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9 o de una célula huésped según una de las reivindicaciones 10 a 12 o de un vector de expresión según la reivindicación 13 o 14 o de un kit según la reivindicación 15 para producir una o varias proteínas.

18. Método para producir una o varias proteínas que comprende:

(i) introducir un vector de expresión según la reivindicación 13, que contiene un ADN según la reivindicación 7, a una célula huésped que es adecuada para producir la proteína recombinante, opcionalmente después de la inducción de la secuencia promotora;

(ii) cultivar la célula huésped obtenida en (i) ;

(iii) y opcionalmente inducir la secuencia promotora de una manera conocida para los cual se prepara (n) la (s) proteína (s) por parte de la célula huésped.

19. Método para producir una o varias proteínas que comprende:

(i) construir el vector de expresión que contiene un ADN según la reivindicación 7;

(ii) introducir un vector de expresión a una célula huésped que es adecuada para producir una proteína recombinante, opcionalmente después de la inducción de la secuencia promotora;

(iii) cultivar la célula huésped obtenida en (ii) ;

(iv) y opcionalmente inducir la secuencia promotora de una manera conocida per se, por lo cual se produce (n) la (s) proteína (s) por parte de la célula huésped.

20. Método para la preparación de vectores de expresión según una de las reivindicaciones 13 o 14, que comprende:

(i) insertar un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9 a un vector de expresión; o

(ii) modificar una secuencia de promotor de Hansenula polymoría, en cuyo caso el promotor se selecciona del grupo compuesto del promotor MOX, FMD y TPS1, a un vector de expresión mediante inserción, deleción y/o intercambio de al menos un par de bases de una manera conocida per se, en cuyo caso la eficiencia de transcripción de esta secuencia de promotor se modula en comparación con la eficiencia del promotor de tipo silvestres modificando un sitio de enlace de ADN, en cuyo caso la modificación se efectúa por palindromización de al menos una de las secuencias de ADN según SEQ ID No: 1-4, 11, 13, 16 y 20 y en cuyo caso la secuencia palindromizada no se desvía en más de 2 bases por cadena de una secuencia completamente palindromizada; y

(iii) introducir opcionalmente un gen heterólogo de una manera conocida per se a un vector de expresión, de modo que el gen heterólogo se encuentre bajo control de transcripción del ADN de (a) o (b) .