Producción in vitro de una población de células usando células nodrizas.

Un método para la expansión in vitro de una población P' de células T de mamífero a partir de una población Pde células T de mamífero en un medio de cultivo Mp,

en donde dicha expansión requiere la presencia de al menosdos factores en dicho medio de cultivo, en donde dicho método comprende las siguientes etapas:

a) cultivar las células nodrizas de insecto capaces de expresar o secretar los factores que comprenden:

- un anticuerpo anti-CD3 modificado, en donde la modificación del anticuerpo anti-CD3 consiste en lasustitución del dominio intracitoplasmático anti-CD3 de la cadena pesada anti-CD3 con un dominiotransmembrana, dicho anticuerpo anti-CD3 modificado está anclado a la membrana celular de lascélulas nodrizas y es susceptible de interactuar con la proteína del complejo TCR/CD3 de las células T,o una variante de esta,

- una proteína CD80 o CD86, preferentemente una proteína CD80, anclada a la membrana celular delas células nodrizas, que es susceptible de interactuar con la proteína CD28 de las células T, o unavariante de esta, y

- opcionalmente, IL-2 la que cuando es secretada es susceptible de interactuar con el receptor IL-2 delas células T, o una variante de esta,a una temperatura T1 en un medio de cultivo Mf, tal T1 permite la proliferación de dichas células nodrizas,

b) poner en contacto las células nodrizas obtenidas en la etapa (a) removidas o no de su medio de cultivoMf, con la población P de células T contenidas en el medio de cultivo Mp, en donde dicho medio de cultivoMp no contiene inicialmente los al menos dos factores, para obtener una mezcla que contiene la poblaciónP de células T, células nodrizas y el medio de cultivo Mp,

c) cultivar la mezcla obtenida en la etapa (b) que contiene al menos los dos factores que se expresan porlas células nodrizas en el medio de cultivo Mp, donde dicha etapa (c) de cultivo se efectúa a unatemperatura T2, dicha temperature T2 se selecciona de manera que:

- la población P de células T prolifere, y

- las células nodrizas no proliferen,

y en donde la población P de células T' se expande,

d) recuperar la población P de células T' así expandida,en donde dicho método es capaz de mantener el crecimiento exponencial de la población P de células T'por al menos dos o tres meses.

Producción in vitro de una población de células usando células nodrizas

La invención se relaciona con un método para la expansión in vitro de una población de células P' a partir de una población de células P, dicha expansión requiere la presencia de al menos dos factores que se expresan por las células nodrizas de insecto, en donde a) las células nodrizas proliferan a una temperatura T1, b) las células nodrizas están en contacto con la población de células P, c) la mezcla celular obtenida en la etapa (b) se cultiva a una temperatura T2 la cual se selecciona de manera que la población de células P prolifere y las células nodrizas no proliferen, el al menos un factor se expresa por las células nodrizas, y d) la población de células P' así obtenida se recupera. Ventajosamente, la producción consiste en una expansión, las células nodrizas son células nodrizas de insecto y la población de células P que prolifera es una población de linfocitos T, preferentemente una población de linfocitos Tr1.

La terapia celular es un grupo de nuevas técnicas basadas en particular en reemplazar células afectadas o disfuncionales con sanas, que están en funcionamiento. Además, la terapia celular tiene aplicaciones en inmunoterapia involucrando linfocitos. Estas nuevas técnicas se aplican a una amplia variedad de enfermedades humanas, incluyendo muchos tipos de cáncer, enfermedades neurológicas tales como el Parkinson y la enfermedad de Lou Gehrig, lesiones de la médula espinal, y diabetes, las enfermedades autoinmunes o inflamatorias.

Las células son componentes básicos del cuerpo humano y mantienen muchas de las claves de cómo funciona el cuerpo. Las células tienen un rol tanto estructural como funcional en el cuerpo, ejecutando una variedad casi infinita de acciones para mantener los tejidos y órganos del cuerpo. Existen cientos, quizás miles de tipos distintos de células especializadas en el cuerpo de un adulto. Todas estas células desempeñan funciones muy específicas para el tejido u órgano que componen. Estas células maduras se diferencian, o se dedican a ejecutar sus tareas especiales.

Los trasplantes de médula ósea son un ejemplo de terapia celular en los cuales las células madre en un donante de médula ósea se usan para reemplazar las células sanguíneas de las víctimas de leucemia y otros tipos de cáncer. La terapia celular también se usa en experimentos para injertar nuevas células de la piel para tratar a víctimas de quemaduras graves, y para crecer de nuevo la córnea para los débiles visuales. En todos esos usos, el objetivo es que las células sanas se integren dentro del cuerpo y comiencen a funcionar como las células propias del paciente. Además, numerosos estudios están actualmente en proceso para cebar y expandir linfocitos T para usarlos como tratamiento inmunoterapéutico para el cáncer y enfermedades infecciosas, entre otros.

Sin embargo, hay varios retos científicos que deben superarse en el campo de la terapia celular. Uno de los retos consiste en proporcionar sistemas de expansión/diferenciación para inducir a una población de células a que proliferen rápidamente durante largo tiempo y en cantidad suficiente. Por ejemplo, en ensayos clínicos de inmunoterapia de células T, se usan miles de millones de células. Con el fin de producir estas cantidades de células, se requiere normalmente la expansión de células de 1000 a 4000 veces. Además, para un potencial de trasplante óptimo y posibles beneficios terapéuticos, es importante garantizar que las células, después de la expansión in vitro, sean funcionales, no envejezcan y que no estén contaminadas en el momento de la administración a un paciente

Una posibilidad para obtener una población celular de interés es su identificación en una muestra biológica, basado en la determinación de la presencia de marcadores específicos para la población celular en cuestión, y entonces proceder a su enriquecimiento eliminando las células que no expresan marcadores específicos. Sin embargo, dicho método no proporciona una cantidad suficiente de células para la terapia o con fines de investigación.

Así pues, existe la necesidad de un sistema de producción de células en donde dichas células pueden diferenciarse y/o expandirse, tal como un sistema de expansión celular capaz de mantener un crecimiento exponencial de una población celular por al menos dos o tres meses in vitro, y tener una población celular muy bien caracterizada para los propósitos de inyección, en contraste con una población de células mixta enriquecida con las células requeridas pero contaminadas con células que pueden tener efectos adversos.

En el campo de la inmunoterapia, los métodos de clonación y expansión de células T han mostrado tener ciertos inconvenientes, entre ellos la apoptosis y cultivos a largo plazo (se requieren varios meses) para obtener una cantidad suficiente de células procedentes de un único clon. Se ha demostrado previamente que las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 pueden usarse como células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) para apoyar el crecimiento a largo plazo de células T CD4+ (ver la patente norteamericana publicada el 5 de marzo de 2002 con el número US 6, 352, 694) . Sin embargo, las perlas o placas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 no pueden apoyar el crecimiento a largo plazo de las células T CD8+ purificadas, y se incluyen otras limitaciones, como son el elevado costo de las perlas, el proceso de trabajo intenso involucrado para remover las perlas del medio de cultivo antes de la infusión, y el hecho de que el sistema basado en las perlas se restringe por la necesidad de la aprobación del control de calidad de GM (Buena Fabricación) antes del comienzo de cada aplicación.

La solicitud de patente norteamericana publicada el 7 de agosto de 2003 con el número US 2003/0147869 describe el uso de aAPC manipuladas por los inventores para imitar células dendríticas en su capacidad para estimular el crecimiento rápido de CTL. Según esta solicitud de patente, la línea celular eritromieloide K562 se usa porque (1) es de origen humano; (2) carece de moléculas MHC de clase I y II para evitar la respuesta alogénica; (3) crece bien usando medio libre de suero; (4) se ha usado ampliamente en la bibliografía (más de 5700 referencias) ; (5) se ha caracterizado citogenéticamente; y (6) ha sido aprobada en la primera fase de ensayos clínicos.

Ciertamente, las células eucariotas se prefieren usualmente en lugar de células procariotas, puesto que la expresión de proteínas eucariotas en células eucariotas puede provocar la glicosilación parcial o completa y/o la formación de enlaces disulfuro intra o intercatenarios de una proteína recombinante.

Un inconveniente importante relacionado con el uso de tales aAPC es que es necesario proceder a su irradiación antes de contactar con la población celular a expandir, para frenar su crecimiento. Esta irradiación requiere estimular repetidamente la población celular a expandir, y llevar a la consiguiente introducción de aAPC irradiada en el entorno clínico. Además, la irradiación de aAPC puede causar mutaciones genéticas, que pueden conducir a la producción de factores no deseables. Tales mutaciones no pueden ser controladas y no es posible estar totalmente seguros de que la proliferación ha detenido la proliferación de todas las aAPC.

Otro inconveniente correlacionado con el uso de células eucariotas aAPC es que estas pueden permitir la proliferación de los virus eucariotas presentes en Ia población celular a expandir.

Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron que es posible producir una población de células P' a partir de una población celular P usando un sistema de células nodrizas de insecto que difiere del actual sistema aAPC. Dicho sistema de células nodrizas de insecto consiste en células nodrizas que expresan factor (es) que permiten la producción de dicha población celular P', en donde la temperatura de cultivo de las células nodrizas (T1) es diferente del de la población celular P (T2) de la cual se produce la población celular P'. Las células nodrizas se cultivan primeramente a una temperatura T1 en un medio de cultivo Mf. Cuando las células nodrizas se ponen en contacto con la población celular P, se pueden remover o no de su medio de cultivo Mf. El medio de cultivo Mp inicialmente no contiene los dos factores mínimos. La mezcla de células nodrizas obtenida, la población celular P y el medio de cultivo Mp se cultivan entonces... [Seguir leyendo]

1. Un método para la expansión in vitro de una población P' de células T de mamífero a partir de una población P de células T de mamífero en un medio de cultivo Mp, en donde dicha expansión requiere la presencia de al menos dos factores en dicho medio de cultivo, en donde dicho método comprende las siguientes etapas:

a) cultivar las células nodrizas de insecto capaces de expresar o secretar los factores que comprenden:

- un anticuerpo anti-CD3 modificado, en donde la modificación del anticuerpo anti-CD3 consiste en la sustitución del dominio intracitoplasmático anti-CD3 de la cadena pesada anti-CD3 con un dominio transmembrana, dicho anticuerpo anti-CD3 modificado está anclado a la membrana celular de las células nodrizas y es susceptible de interactuar con la proteína del complejo TCR/CD3 de las células T,

o una variante de esta,

- una proteína CD80 o CD86, preferentemente una proteína CD80, anclada a la membrana celular de las células nodrizas, que es susceptible de interactuar con la proteína CD28 de las células T, o una variante de esta, y

- opcionalmente, IL-2 la que cuando es secretada es susceptible de interactuar con el receptor IL-2 de las células T, o una variante de esta,

a una temperatura T1 en un medio de cultivo Mf, tal T1 permite la proliferación de dichas células nodrizas,

b) poner en contacto las células nodrizas obtenidas en la etapa (a) removidas o no de su medio de cultivo Mf, con la población P de células T contenidas en el medio de cultivo Mp, en donde dicho medio de cultivo Mp no contiene inicialmente los al menos dos factores, para obtener una mezcla que contiene la población P de células T, células nodrizas y el medio de cultivo Mp,

c) cultivar la mezcla obtenida en la etapa (b) que contiene al menos los dos factores que se expresan por las células nodrizas en el medio de cultivo Mp, donde dicha etapa (c) de cultivo se efectúa a una temperatura T2, dicha temperature T2 se selecciona de manera que:

- la población P de células T prolifere, y

- las células nodrizas no proliferen,

y en donde la población P de células T' se expande,

d) recuperar la población P de células T' así expandida,

en donde dicho método es capaz de mantener el crecimiento exponencial de la población P de células T' por al menos dos o tres meses.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las células nodrizas mueren durante la etapa (c) .

3. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa (d) se eliminan la membrana celular y los fragmentos de ADN de las células nodrizas que resultan de la muerte de dichas células.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la eliminación de la membrana celular y los fragmentos de ADN comprende las siguientes etapas:

- opcionalmente, una etapa de lavado con una solución de albúmina,

- una etapa de separación en una solución de gradiente de densidad, en donde el índice de densidad está comprendido entre aproximadamente 1, 120 y aproximadamente 1, 146.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células nodrizas son células recombinantes y contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica dichos al menos dos factores.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células nodrizas son de la línea celular de Drosophila S2 depositada el 25 de marzo de 2005 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) bajo el número 1-3407.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde T1 es inferior a T2 y T2 es al menos aproximadamente 35°C.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medio de cultivo Mp y/o el medio Mf es un medio de cultivo libre de suero.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde en la etapa (b) las células nodrizas se remueven de su medio de cultivo Mf.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el dominio transmembrana que reemplaza el dominio intracitoplasmático de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 es el dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la población de células T es una población de células Tr1, y en donde las células nodrizas expresan además factores que interactúan con las siguientes proteínas de la superficie celular adicionales de la población de células Tr1:

- la proteína CD2,

- el receptor de interleuquina 2 (IL-2) , y

- el receptor de interleuquina 4 (IL-4) .

12. El método de la reivindicación 11, en donde dichos factores son:

- la proteína CD58 anclada a la membrana celular de células nodrizas, que es susceptible de interactuar con la proteína CD2 de las células Tr1, o una variante de esta, y

- una interleuquina seleccionada del grupo que consiste de IL-4 e interleuquina 13 (IL-13) , preferentemente IL-4, dicha interleuquina es secretada por las células nodrizas y es susceptible de interactuar con el receptor IL-4 de las células Tr1, o una variante de esta.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las células de dicha población P de células mamíferas son células humanas.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde los al menos dos factores son de origen humano.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la cadena ligera del anticuerpo anti-CD3 modificado es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:1, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:1, y en donde la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 modificado es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:2, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:2.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en donde la proteína CD80 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:3, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:3.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde la proteína CD86 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:4, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:4.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la IL-2 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:5, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:5 .

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde la proteína CD58 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:6, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:6.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en donde la IL-4 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:7, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:7.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en donde la IL-13 es codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia sec. con núm. de ident.:8, o cualquier ácido nucleico que tenga al menos 70% de identidad con la sec. con núm. de ident.:8.