Una vacuna o inóculo que comprende una cantidad inmunogénica eficaz de ensamblajes similares a cuerposproteicos recombinantes (RPBLA) que contienen una proteína de fusión recombinante disuelta o dispersa enun diluyente farmacológicamente aceptable,

dicha proteína de fusión recombinante contiene dos secuenciasunidas entre sí en la que una secuencia es una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS) y la otra esun polipéptido inmunogénico biológicamente activo contra el que se va a inducir una respuesta inmunológicamediante dicha vacuna o inóculo, en donde la PBIS es la de un compuesto de prolamina para su uso en lageneración de una respuesta inmune de células B o células T en un animal huésped contra el polipéptidoinmunogénico

Producción de proteínas biológicamente activas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional con número de serie 60/776.391 que se presentó el 23 de febrero de 2006.

Campo técnico

La presente invención contempla la producción de péptidos y proteínas recombinantes biológicamente activos, denominados colectivamente como polipéptidos, en células y organismos eucariotas como sistemas huésped. Más particularmente, se fusiona un polipéptido biológicamente activo a una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS, por sus siglas en inglés) que media la inducción de productos ensamblados de tipo cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA, por sus siglas en inglés) para formar una proteína de fusión que se expresa de manera estable y se acumula en el sistema huésped como un RPBLA tras la transformación de las células huésped con un vector apropiado.

Antecedentes técnicos

La producción de proteínas recombinantes para usos terapéuticos, nutracéuticos o industriales ha disfrutado de un gran éxito a lo largo de la última década. La introducción de genes heterólogos que tienen una secuencia de nucleótidos deseada produce la expresión de un polipéptido o proteína que tiene la estructura primaria o secuencia de residuos de aminoácidos deseada correspondiente. Sin embargo, en muchos casos la proteína o polipéptido expresado tenía la secuencia de residuos de aminoácidos del material natural, pero carecía de la actividad biológica de ese material.

La actividad biológica, dada la estructura primaria apropiada del producto expresado, puede ser una función del producto que tiene el plegamiento y los enlaces de hidrógeno, Van der Waals, iónicos y disulfuro internos apropiados, y que también tiene una modificación postraduccional apropiada, tal como por ejemplo glicosilación. Por ejemplo, la formación de enlaces disulfuro se produce espontáneamente en la luz del retículo endoplasmático (RE) , pero no en el citosol de procariotas, lo que hace que células bacterianas tales como células E. coli sean malos huéspedes para la síntesis de proteínas de mamífero correctamente plegadas que se estabilizan normalmente mediante enlaces disulfuro. La formación de enlaces disulfuro puede producirse en el espacio periplasmático de E. coli en el que proteínas de tipo PDI son funcionales (Fernandez, et al., 2001. Mol. Microbiol. Abr 40 (2) :332-346) , sin embargo el sistema oxi-redox no es muy eficaz.

Un caso particular se refiere a eritropoyetina (EPO) , una proteína que estimula la producción de glóbulos rojos. La EPO recombinante se da a conocer en la patente estadounidense número 4.703.008 concedida a Lin. La patente da a conocer actividades para la proteína EPO expresada a partir de E. coli, S. cerevisiae, y células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón de mono verde africano (COS-1) de mamífero. Aunque los antisueros contra EPO reaccionaron de manera inmunológica con EPO expresada por cada tipo de célula, sólo las proteínas expresadas de células de mamífero mostraron actividad biológica in vivo sustancial como EPO, y concentraciones similares mediante ensayo de anticuerpos, ensayos in vitro e in vivo. La proteína expresada por mamíferos es la usada para tratar seres humanos.

Se cree que esas diferencias en la actividad biológica eran una función de la glicosilación ya que E. coli, un procariota, no puede glicosilar sus proteínas expresadas. Las células de levaduras son eucariotas, pero su patrón de glicosilación para proteínas secretadas es diferente al de los mamíferos. Por otra parte, las células CHO y COS-1 usadas para proporcionar proteína con actividad biológica sustancial eran de mamífero y la proteína expresada a partir de las mismas fue útil. Estudios publicados de EPO glicosilada y no glicosilada indican que la glicosilación desempeña un papel crítico en la estabilización de la eritropoyetina frente a condiciones desnaturalizantes. Narhi et al., (1991) J. Biol. Chem. 266 (34) :23022-23026. Además, se ha descrito que la vida útil in vivo y la actividad de EPO pueden relacionarse con la glicosilación de la molécula.

Por tanto, se prefieren enormemente las células eucariotas para la producción recombinante de proteínas útiles terapéuticas, industriales y otras de origen eucariota. Se ha mostrado que diferentes células y organismos eucariotas pueden producir productos terapéuticos basados en proteínas. Desafortunadamente, los elevados costes derivados con frecuencia de bajos niveles de producción de proteínas recombinantes y/o de los procedimientos de aislamiento y purificación de proteínas, pueden invalidar su aplicación industrial. Se realiza una investigación activa para mejorar tanto los niveles de producción como los procedimientos de purificación mediante diferentes enfoques.

Una manera de mejorar la eficacia del aislamiento de proteínas recombinantes es por medio de concentración intracelular. Uno de estos enfoques es la agregación al azar de proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión no secretados que pueden separarse de células lisadas mediante técnicas de purificación basadas en densidad. Los

cuerpos de inclusión son depósitos de proteínas amorfos encontrados en bacterias. Estudios de caracterización estructural mostraron que la naturaleza insoluble de los cuerpos de inclusión puede deberse a interacciones intermoleculares hidrófobas de proteínas con plegamiento no nativo (Seshadri et al., 1999, Methods Enzymol. 309:559-576) . La estrategia general usada para recuperar proteínas activas a partir de cuerpos de inclusión requiere la solubilización de la proteína para romper los agregados al azar seguido por una o más etapas de replegamiento químico. Esto es un problema importante que debe solucionarse dado que la eficacia de renaturalización de proteínas desnaturalizadas puede estar limitada, principalmente si la proteína contiene enlaces disulfuro (Clarc, Ed., Abr. 2001 Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2) :202-207) .

Más particularmente, se usan desnaturalizantes fuertes tales como alta concentración de agentes caotrópicos (es decir urea y clorhidrato de guanidinio) para solubilizar proteínas no plegadas que se acumulan en agregados. Posteriormente los desnaturalizantes se eliminan mediante diálisis en un intento de replegar la proteína en una conformación natural. La actividad biológica de tales proteínas replegadas es normalmente muy inferior a la de la proteína con forma nativa.

Los cuerpos proteicos (PB, por sus siglas en inglés) son estructuras naturales en ciertas semillas de plantas que han evolucionado para concentrar proteínas de reserva intracelularmente en células eucariotas al tiempo que conservan un plegamiento correcto y actividad biológica. Los cuerpos proteicos (PB) comparten algunas de las características de los cuerpos de inclusión de bacterias. Son densos y contienen una alta cantidad de proteínas agregadas que están estrechamente empaquetadas mediante interacciones hidrófobas [Momany et al., 2006 J Agric. Food Chem. 2 5Ene; 54 (2) :543-547 y Garrat, et al., 1993 Proteins Ene; 15 (1) :88-99]. Además, la presencia de una gran cantidad de enlaces disulfuro en algunas de las PBIS, tales como por ejemplo RX3, [Ludevid, et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227234 y Kawagoe et al., 2005 Plant Cell Abr 17 (4) :1141-1153], que están probablemente implicadas en la formación y estabilización de PB, podría representar una dificultad adicional para producir una proteína con plegamiento nativo biológicamente activa, particularmente una proteína que contiene residuos de cisteína.

Por tanto, la observación de actividad biológica sin necesidad de replegamiento y renaturalización de una amplia variedad de proteínas producidas en PB sintéticos en huéspedes eucariotas distintos de levaduras fue inesperada.

Se ha desarrollado una nueva tecnología basada en la fusión de un dominio de proteína de reserva de semillas de plantas con la proteína de interés (documento WO 2004/003207) para aumentar la estabilidad y acumulación de proteínas recombinantes en plantas superiores. Estas proteínas de reserva son específicas para semillas de plantas en las que se acumulan de manera estable en cuerpos proteicos (Galili et al., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442) .

Las proteínas de reserva se insertan en la luz del retículo endoplasmático (RE) mediante un péptido señal y se ensamblan o bien en... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna o inóculo que comprende una cantidad inmunogénica eficaz de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que contienen una proteína de fusión recombinante disuelta o dispersa en 5 un diluyente farmacológicamente aceptable, dicha proteína de fusión recombinante contiene dos secuencias unidas entre sí en la que una secuencia es una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS) y la otra es un polipéptido inmunogénico biológicamente activo contra el que se va a inducir una respuesta inmunológica mediante dicha vacuna o inóculo, en donde la PBIS es la de un compuesto de prolamina para su uso en la generación de una respuesta inmune de células B o células T en un animal huésped contra el polipéptido

inmunogénico.

2. La vacuna o inóculo según la reivindicación 1 en donde dicha proteína de fusión incluye además una secuencia enlazadora entre la secuencia inductora de cuerpos proteicos y la secuencia del polipéptido inmunogénico biológicamente activo.

3. La vacuna o inóculo según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el compuesto de prolamina es gamma-zeína, alfa-zeína, gamma-gliadina o prolamina de arroz.

4. La vacuna o inóculo según la reivindicación 3, en donde el compuesto de prolamina es la secuencia RX3 de 20 gamma-zeína.