Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas.

Una célula microbiana eucariótica recombinante, seleccionada del grupo que consiste en una levadura y en unhongo filamentoso,

que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversiónde fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, en donde se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia deaminoácidos que tiene una identidad de al menos el 55% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/oSEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de nucleótidos se expresa en el citosol y la enzima es activa en el citosol.

Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas La presente invención se refiere a una célula eucariótica recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, y a un procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico.

Los ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos, ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico son potenciales precursores para numerosos productos químicos. Por ejemplo, el ácido succínico se puede convertir en 1, 4-butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado de ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara enlazando ácido succínico y BDO.

El ácido succínico se produce predominantemente a través de procedimientos petroquímicos mediante hidrogenación de butano. Se considera que estos procedimientos son perjudiciales para el medio ambiente y costosos. La producción fermentativa de ácido succínico puede ser un procedimiento alternativo atractivo para la producción de ácido succínico, en el que se puede utilizar un material de alimentación renovable como fuente de carbono.

Se conoce que un cierto número de diferentes bacterias tales como Escherichia coli y las bacterias de la panza Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia o Succinimonas sp. producen ácido succínico. La ingeniería metabólica de estas cepas bacterianas ha mejorado el rendimiento y/o productividad de ácido succínico, o ha reducido la formación de subproductos.

Lin et al., 2005, Metabolic Engineering 7, págs. 116-127, por ejemplo, describen que la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa a partir de Sorghum en E. coli era eficaz para aumentar la producción de succinato en sistemas de producción aerobios de E. coli.

El documento WO 2007/061590 describe una levadura piruvato descarboxilasa negativa para la producción de ácido málico y/o ácido succínico, la cual se transforma con una enzima piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una enzima malato deshidrogenasa y una proteína transportadora de ácido málico (MAE) .

Bauer et al., 1999, FEMS Microbiology Letters 179, págs. 107-112 describen que la expresión de la fosfoenolpiruvato carboxilasa a partir de Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae y cepas de S. cerevisiae que sobre-expresan piruvato carboxilasa producía una mayor cantidad de malato en comparación con el tipo salvaje.

Kubo et al., 2000, J. Bioscience and Bioengineering, 90, págs. 619-624 describe que la interrupción de genes de succinato deshidrogenasa en S. cerevisiae incrementaba la producción de ácido succínico bajo condiciones de sacudimiento, pero no bajo condiciones estáticas y de elaboración de sake.

Goldberg et al., 2006, J. Chem. Techn. Biotechnol. 81, pág. 1601-1611 reseña la importancia del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) citosólico reductivo, que incluye las actividades citosólicas de piruvato carboxilasa, malato deshidrogenasa y fumarasa para la producción de ácido fórmico y ácido málico en hongos filamentosos.

Sanville Millard et al., 1996, Appl. Environm. Microbiol. 62, págs. 1808-1810 describe que la producción fermentativa de ácido succínico a partir de glucosa por parte de Escherichia coli se incrementó significativamente mediante la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa. En contraposición, la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa no tenía efecto alguno.

A pesar de las mejoras que se han realizado en la producción fermentativa de ácido dicarboxílico, sigue existiendo una necesidad de microorganismos mejorados para la producción fermentativa de ácidos dicarboxílicos, en particular ácido succínico.

El objetivo de la presente invención es un microorganismo eucariótico alternativo para la producción de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico.

El objetivo se consigue de acuerdo con la invención con una célula microbiana eucariótica recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, con lo que se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 5% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:5, en donde la secuencia de nucleótidos es expresada en el citosol, y la enzima es activa en el citosol.

Preferiblemente, la enzima tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, preferiblemente la enzima es una fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa (E.C. 4.1.1.49) . Preferiblemente, la PEP carboxiquinasa es activa bajo condiciones anaerobias o limitadas en oxígeno en presencia de una fuente de carbono fermentable o glicerol. Una fuente de carbono fermentable puede ser glucosa, fructosa, galactosa, rafinosa, arabinosa o xilosa. Se encontró ventajoso que la célula eucariótica comprendiera una PEP carboxiquinasa de acuerdo con la presente invención, dado que la PEP carboxiquinasa, que cataliza la conversión de PEP en OAA fija CO2 y genera energía en forma de ATP.

Sorprendentemente, se encontró que una célula eucariótica recombinante de acuerdo con la presente invención produce una cantidad incrementada de ácido dicarboxílico tal como ácido succínico y ácido fumárico en comparación con la cantidad de ácido dicarboxílico producido por una célula eucariótica de tipo salvaje. Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención produce al menos 1, 2, preferiblemente al menos 1, 5, 1, 6, 1, 8, preferiblemente al menos 2 veces más de ácido dicarboxílico que una célula eucariótica de tipo salvaje que no comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato de la invención.

Preferiblemente, una célula microbiana eucariótica de acuerdo con la presente invención expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa, preferiblemente una PEP carboxiquinasa en donde la PEP carboxiquinasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 55%, preferiblemente de al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, la PEP carboxiquinasa comprende la SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5.

La identidad de la secuencia se define en esta memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (poliipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos) , según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las identidades o similitudes entre secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de la secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determina por el apareamiento entre hebras de dichas secuencias.

Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad y para dar el apareamiento mayor entre las secuencias sometidas a ensayo. Métodos para determinar la identidad y similitud son codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. Métodos de programa de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894) . Parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos utilizando BLASTP son hueco abierto 11.0, extensión de hueco 1, matriz Blosum 62.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima expresada en una célula según se describe también se puede definir por su capacidad de hibridarse con secuencias de nucleótidos que codifican una enzima que tiene actividad de PEP carboxiquinasa de SEQ ID NO: 1, 3 y/o 5, o con la secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenada de SEQ ID NO: 14 o con la secuencia de nucleótidos que codifica fumarasa de SEQ ID NO: 16, bajo condiciones de hibridación moderadas o, preferiblemente, bajo condiciones de hibridación rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, de preferencia aproximadamente 50 nucleótidos, 75 ó 100 y, lo más preferiblemente, de... [Seguir leyendo]

1. Una célula microbiana eucariótica recombinante, seleccionada del grupo que consiste en una levadura y en un hongo filamentoso, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, en donde se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 55% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de nucleótidos se expresa en el citosol y la enzima es activa en el citosol.

2. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enzima es una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa.

3. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la enzima es una enzima heteróloga, preferiblemente derivada de una bacteria.

4. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula es una levadura, preferiblemente una Saccharomyces cerevisiae, o un hongo filamentoso tal como Aspergillus niger.

5. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula sobre-expresa, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una piruvato carboxilasa.

6. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa, en donde la malato deshidrogenasa es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica malato deshidrogenasa.

7. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico en el citosol, tras la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico.

8. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde al menos un gen que codifica succinato deshidrogenasa no es funcional.

9. Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, que es una Aspergillus niger que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxquinasa de SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8.

10. Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, que es una Saccharomyces cerevisiae que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa de SEQ ID NO: 9 y/o SEQ ID NO:

10.

11. Un procedimiento para la preparación de ácido succínico, que comprende fermentar la célula microbiana eucariótica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un medio de fermentación adecuado, y preparar el ácido succínico.

12. Un caldo de fermentación que comprende ácido succínico, en donde el caldo de fermentación se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11.