Procedimientos para la determinación cuantitativa de la densidad de metilación en un locus de ADN.
Un procedimiento para cuantificar la densidad de metilación en un locus de ADN genómico en comparación con un control,
procedimiento que comprende digerir parcialmente ADN genómico con McrBC en el que dicha digestión no se lleva a cabo hasta completitud;
cuantificar copias intactas del locus por amplificación cuantitativa, produciéndose así un producto de amplificación; y comparar la cantidad de copias intactas del locus con un valor de control que representa la cantidad de metilación de ADN de control, cuantificándose así la densidad de metilación en el locus en comparación con la densidad de metilación del ADN de control.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/035177.
Solicitante: ORION GENOMICS, LLC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 4041 FOREST PARK AVENUE ST. LOUIS, MO 63108 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: JEDDELOH,Jeffrey A, LAKEY,Nathan D.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
- C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12P19/34 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/48 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
- G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
- G06F19/00
PDF original: ES-2382780_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimientos para la determinación cuantitativa de la densidad de metilación en un locus de ADN.
Referencia cruzada a las solicitudes de patente relacionadas La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad a la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/561.721 presentada el 12 de abril de 2004, la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/561.563 presentada el 12 de abril de 2004 y la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/513.426 presentada el 21 de octubre 2003.
Antecedentes de la invención
Las células cancerosas humanas normalmente contienen genomas somáticamente alterados caracterizados por mutación, amplificación o deleción de genes críticos. Además, el molde de ADN de células cancerosas humanas frecuentemente muestra cambios somáticos en la metilación de ADN. Véanse, por ejemplo, E. R. Fearon y col., Cell 61:759 (1990) ; P. A. Jones y col., Cancer Res. 46:461 (1986) ; R. Holliday, Science 238:163 (1987) ; A. De Bustros y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5693 (1988) ; P. A. Jones y col., Adv. Cancer Res. 54:1 (1990) ; S. B. Baylin y col., Cancer Cells 3:383 (1991) ; M. Makos y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:1929 (1992) ; N. Ohtani-Fujita y col., Oncogene 8:1063 (1993) .
Las ADN metilasas transfieren grupos metilo del donante de metilo universal S-adenosil-metionina a sitios específicos sobre el ADN. Se han atribuido varias funciones biológicas a las bases metiladas en ADN. La función biológica más establecida es la protección del ADN de la digestión por enzimas de restricción relacionadas. Este fenómeno de modificación de la restricción sólo se ha observado hasta ahora en bacterias.
Sin embargo, las células de mamífero poseen una metilasa diferente que metila exclusivamente residuos de citosina sobre el ADN que son vecinos de 5' de guanina (CpG) . Se ha mostrado por varias líneas de evidencia que esta metilación desempeña una función en la actividad génica, diferenciación de células, tumorigénesis, inactivación del cromosoma X, huella genómica y otros procesos biológicos importantes (Razin, A., H., y Riggs, R. D. eds. En DNA Methylation Biochemistr y and Biological Significance, Springer Verlag, N.Y., 1984) .
En células eucariotas, la metilación de residuos de citosina que están inmediatamente 5' con respecto a una guanosina se produce predominantemente en locus pobres en CG (Bird, A., Nature 321:209 (1986) ) . A diferencia, regiones discretas de dinucleótidos CG llamadas islas de CpG siguen sin estar metiladas en células normales, excepto durante la inactivación del cromosoma X y huella específica parental (Li y col., Nature 366:362 (1993) ) en la que la metilación de regiones reguladoras en 5' puede conducir a represión de la transcripción. Por ejemplo, se ha demostrado la metilación de novo del gen Rb en una pequeña fracción de retinoblastomas (Sakai y col., Am. J. Hum. Genet., 48:880 (1991) ) , y un análisis más detallado del gen VHL mostró metilación anormal en un subconjunto de carcinomas de células renales esporádicas (Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9700 (1994) ) . La expresión de un gen supresor de tumores también puede abolirse por la metilación de ADN de novo de una isla de CpG en 5' normalmente sin metilar. Véase, por ejemplo, Issa y col., Nature Genet. 7:536 (1994) ; Merlo y col., Nature Med. 1:686 (1995) ; Herman y col., Cancer Res., 56:722 (1996) ; Graff y col., Cancer Res., 55:5195 (1995) ; Herman y col., Cancer Res. 55:4525 (1995) .
Pham Tho y col. (2003) American J. Physiol., 285 (2) :R962-R970 se refiere a insuficiencia uteroplacentaria aumentando la apoptosis y alterando la metilación del gen p53 en el riñón de rata con IUGR nacida a término. Chu y col. (2002) J. Urol., 167 (4) :1854-1858 se refieren al uso de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real para detectar hipermetilación de las islas de CpG en la región promotora que flanquea el gen Gstp 1 para diagnosticar carcinoma de próstata. Chotai y col. (1998) J. Med. Gen., 35 (6) : 472-475 se refieren a una prueba de PCR rápida para el diagnóstico molecular diferencial de síndromes de Prader-Willi y Angelman.
La identificación de los cambios genéticos más tempranos en tumorigénesis es un objetivo principal en la investigación del cáncer molecular. Los enfoques de diagnóstico basados en la identificación de estos cambios pueden permitir la implementación de estrategias de detección tempranas, estadificación del tumor y enfoques terapéuticos novedosos que eligen como diana estos cambios tempranos, conduciendo a tratamiento contra el cáncer más eficaz. La presente invención trata estos y otros problemas.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para cuantificar la densidad de metilación en un locus de ADN genómico en comparación con un control, procedimiento que comprende digerir parcialmente ADN genómico con McrBC en el que dicha digestión no se lleva a cabo hasta completitud;
cuantificar copias intactas del locus por amplificación cuantitativa, produciéndose así un producto de amplificación; y comparar la cantidad de copias intactas del locus con un valor de control que representa la cantidad de metilación de ADN de control, cuantificándose así la densidad de metilación en el locus en comparación con la densidad de metilación del ADN de control.
En algunas realizaciones, la cantidad del producto amplificado se compara con una curva patrón.
La etapa de amplificación puede comprender hibridar dos cebadores de oligonucleótidos con ADN que flanquea el locus para producir un producto de amplificación correspondiente al locus sin escindir de ADN genómico entre los cebadores.
En algunas realizaciones, el valor de control representa la cantidad de un producto de amplificación de una muestra de ADN que tiene un número conocido o predicho de nucleótidos metilados.
La enzima de restricción es McrBC.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto el ADN genómico con un agente que modifica citosina sin metilar antes de la etapa de amplificación, y al menos uno de los dos cebadores de oligonucleótidos distingue entre ADN sin metilar y metilado modificado en el ADN genómico.
En algunas realizaciones, el agente es bisulfito de sodio.
En algunas realizaciones, el valor de control se genera poniendo en contacto ADN que comprende un locus de control con McrBC; amplificando el locus de control; y determinando la cantidad de producto amplificado. En algunas realizaciones, el locus de control es conocido o se predice que está sin metilar.
En algunas realizaciones, el valor de control comprende un número conocido de nucleótidos metilados. El ADN genómico puede ser de un ser humano. El procedimiento puede realizarse para detectar la presencia o ausencia de células cancerosas en un sujeto.
La etapa de cuantificación puede comprender detectar una sonda que se hibrida con el producto de amplificación. La sonda puede comprender un resto fluorescente detectable.
La etapa de cuantificación puede comprender la detección directa de copias intactas de locus con captura híbrida.
El ADN puede ser de un animal. El animal puede ser un ser humano.
El ADN genómico puede ser de un tejido seleccionado del grupo que consiste en tejido de cerebro, tejido de colon, tejido urogenital, tejido de pulmón, tejido renal, tejido hematopoyético, tejido de mama, tejido del timo, tejido de testículos, tejido de ovario, tejido uterino y sangre.
El ADN genómico puede ser de un organismo seleccionado del grupo que consiste en plantas, hongos y bacterias.
La presente invención también proporciona procedimientos de cálculo de la densidad de metilación relativa para un locus diana en una muestra de ADN. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de cálculo de la densidad de metilación relativa para un locus diana en una muestra de ADN en comparación con un control, procedimiento que comprende i. digerir parcialmente la muestra de ADN con McrBC en la que dicha digestión no se lleva a cabo hasta completitud;
ii. amplificar cuantitativamente copias intactas del locus en la muestra de ADN después de las etapas de puesta en contacto;
iii. identificar el valor umbral de ciclos (Ct) para la porción amplificada a partir de la muestra de ADN; y, iv. determinar la densidad de metilación relativa... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para cuantificar la densidad de metilación en un locus de ADN genómico en comparación con un control, procedimiento que comprende digerir parcialmente ADN genómico con McrBC en el que dicha digestión no se lleva a cabo hasta completitud;
cuantificar copias intactas del locus por amplificación cuantitativa, produciéndose así un producto de amplificación; y comparar la cantidad de copias intactas del locus con un valor de control que representa la cantidad de metilación de ADN de control, cuantificándose así la densidad de metilación en el locus en comparación con la densidad de metilación del ADN de control.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la cantidad de producto de amplificación se compara con una curva patrón.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el valor de control representa la cantidad de un producto de amplificación de una muestra de ADN que tiene un número conocido o predicho de nucleótidos metilados.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que
el procedimiento comprende además poner en contacto el ADN genómico con un agente que modifica citosina sin metilar antes de la etapa de amplificación, y al menos uno de los dos cebadores de oligonucleótidos distingue entre ADN sin metilar y metilado modificado en el ADN genómico.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el agente es bisulfito de sodio.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el valor de control se genera poniendo en contacto ADN que comprende un locus de control con McrBC; amplificar el locus de control; y determinar la cantidad de producto de amplificación.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el locus de control se sabe o se predice que está sin metilar.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el valor de control comprende un número conocido de nucleótidos metilados.
9. Un procedimiento de cálculo de la densidad de metilación relativa para un locus diana en una muestra de ADN en comparación con un control, procedimiento que comprende,
i. digerir parcialmente la muestra de ADN con McrBC en el que dicha digestión no se lleva a cabo hasta completitud;
ii. amplificar cuantitativamente copias intactas del locus en la muestra de ADN después de las etapas de puesta en contacto;
iii. identificar el valor umbral de ciclos (Ct) para la porción amplificada de la muestra de ADN; y, iv. determinar la densidad de metilación relativa para el locus diana calculando la diferencia (ΔCt) entre Ct de la muestra de ADN y un valor de Ct de control, en el que 2 lΔctl es proporcional a la densidad de metilación relativa entre la muestra de ADN y el control.
Patentes similares o relacionadas:
Método para analizar ácido nucleico molde, método para analizar sustancia objetivo, kit de análisis para ácido nucleico molde o sustancia objetivo y analizador para ácido nucleico molde o sustancia objetivo, del 29 de Julio de 2020, de Kabushiki Kaisha DNAFORM: Un método para analizar un ácido nucleico molde, que comprende las etapas de: fraccionar una muestra que comprende un ácido nucleico molde […]
MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMOS ATÓPICOS SENSIBLES A COMPONENTES ALERGÉNICOS DEL POLEN DE OLEA EUROPAEA (OLIVO), del 23 de Julio de 2020, de SERVICIO ANDALUZ DE SALUD: Biomarcadores y método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la enfermedad alérgica a polen del olivo, kit […]
Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]
Secuenciación dirigida y filtrado de UID, del 15 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un procedimiento para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende: (a) generar una primera secuencia del complemento (CS) de un polinucleótido diana a partir […]
Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras, del 8 de Julio de 2020, de Drawbridge Health, Inc: Un método para estabilizar uno o más componentes biológicos de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el método obtener un […]
Evento de maíz DP-004114-3 y métodos para la detección del mismo, del 1 de Julio de 2020, de PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.: Un amplicón que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o el complemento de longitud completa del mismo.
Composiciones para modular la expresión de SOD-1, del 24 de Junio de 2020, de Biogen MA Inc: Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia […]
Aislamiento de ácidos nucleicos, del 24 de Junio de 2020, de REVOLUGEN LIMITED: Un método de aislamiento de ácidos nucleicos que comprenden ADN de material biológico, comprendiendo el método las etapas que consisten en: (i) efectuar un lisado […]