Procedimiento enzimático para la producción de péptidos bioactivos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina caracterizado porque comprende a) hidrolizar leche de vacuno con una metaloendopeptidasa a una temperatura comprendida entre 30 y 70ºC y durante un tiempo comprendido entre 15 minutos y 5 horas, b) finalizar la reacción de hidrólisis mediante la inactivación de la metaloendopeptidasa, y c) obtener el extracto peptídico crudo resultado de la hidrólisis. Asimismo, contempla el extracto peptídico obtenible por dicho procedimiento y sus aplicaciones en el campo de la alimentación y farmacia

Procedimiento enzimático para la producción de péptidos bioactivos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de péptidos con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina. Concretamente, contempla un procedimiento enzimático para la obtención de un extracto peptídico formado por al menos 65 péptidos bioactivos con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina, basado en el empleo de leche de vacuno, como sustrato de proteínas, y una enzima metaloendopeptidasa. El extracto peptídico obtenido es de utilidad en la industria alimentaria y farmacéutica para el tratamiento y control de la hipertensión arterial.

Antecedentes de la invención La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo cardiovascular de tipo causal prevalente en las sociedades occidentales. De acuerdo a los criterios básicos europeos, la HTA ocurre cuando la presión sistólica es ≥140 mm Hg y la diastólica ≥ 90 mm Hg. En los países desarrollados la HTA afecta a cerca del 40% de la población adulta (Wolf-Maier K, Cooper RS, Banegas JR y col. 2003. JAMA. 289: 2363-2369; Kearney PM, Whelton M, Reynolds K y col. 2005. Lancet. 365: 217-223) . Dentro de esta órbita, la proporción de hipertensos adultos en España es un poco menor (35%) , pero la prevalencia se dispara en personas de mayor edad. Llega a ser más del 60% en personas de más de 60 años. Globalmente, se estima que la HTA en España afecta a unos diez millones de personas (Banegas JR, Rodríguez Artalejo F. 2002. Rev Clin Esp. 202: 12-15; Banegas JR, Rodríguez Artalejo F, Cruz JJ y col. 1998. Hipertensión. 23: 998-1002; Banegas JR, Rodríguez Artalejo F, Ruilope LM y col. 2002. J Hypertens. 20:2157-2164) .

Además, existe un grupo importante de la población que si bien tiene una presión arterial superior a la óptima, ésta no se califica como hipertensión, sino frecuentemente como tensión normal-alta (130-139/85-90) . En Estados Unidos, las séptimas Guías del Comité Nacional Conjunto de Estados Unidos (JNC7) , unifican la presión sanguínea normal y alta-normal y las clasifica como “prehipertensión”. Para ello se invocan las conclusiones proporcionadas por el Estudio Framingham en las que la probabilidad de desarrollar HTA en personas con esta presión es mayor en todas las edades que las que tienen una presión normal (Vasan RS, Beiser A, Seshadri S y col. 2002. JAMA. 287: 1003-1010; Vasan RS, Larson MG, Leip EP y col. 2001. Lancet. 358: 1682-1686) . En España se estima que el 17% de la población adulta está dentro de esta consideración de prehipertensión. Desde el punto de vista sanitario, este grupo merece también atención, pues en él ocurren un número apreciable de eventos cardiovasculares (Chobanian AV, Bakris GL, Black HR y col. 2003. JAMA. 289: 2560-2572; Banegas JR, Rodríguez Artalejo F, Cruz JJ y col. 1999. Med Clin. 112: 489-494) .

La HTA tiene una alta y bien conocida morbimortalidad. Se relaciona con complicaciones cardiovasculares, como la cardiopatía isquémica (Van den Hoogen PCW, Feskens EJM, y col. 2000. N Engl J Med. 342: 1-8; Flack JM, Neaton J, Grimm Rycol. 1995. Circulation. 92: 2437-2445) , la insuficiencia cardíaca (Stamler J, Stamler R, Neaton JD y col. 1999. JAMA. 282: 2012-2018; Mosterd A, D'Agostino RB, Silbershatz H y col. 1999. N Engl J Med. 340: 1221-1227; Vasan RS, Levy D. 1996. Arch Intern Med. 156: 1789-1796; Ho KK, Pinsky JL, Kannel WB y col. 1993. J Am Coll Cardiol. 22 (Supl A) : 6-13; Rich MW. 1999. Cardiol Clin. 17: 123-135) , los accidentes cerebrovasculares (Rodgers A, MacMahon S. 1999. Clin Exp Hypertens. 21: 543-552; Eastern Stroke and Coronar y Heart Disease Collaborative Research Group. 1998. Lancet. 352: 1801-1807; Prospective Studies Collaboration. 1995. Lancet. 346: 1647-1653) , la insuficiencia renal (Perneger TV, Whelton PK, Klag MJ. 1997. J Hypertens. 15: 451-456) , la aterosclerosis obliterante de las extremidades inferiores (Alegría E, Fernández AL, Gutiérrez P. 1997. Hipertensión arterial y arteriopatía periférica. En: Diez J, editor. Enfermedad vascular e hipertensión arterial. Madrid: Harcourt Brace de España) y de otras localizaciones (Liao D, Arnett DK, Tyroler H y col. 1999. Hypertension. 34: 201-206; Safar ME, London GM, Asmar R y col. 1998. Hypertension. 32: 156-161) . El riesgo cardiovascular se incrementa notablemente cuando se suman otros factores, como el tabaquismo, la hipercolesterolemia y la hiperglucemia.

Cuando la HTA no está controlada contribuye a incrementar las complicaciones cardiovasculares que generan en España más de cinco millones de estancias hospitalarias cada año y es el motivo de consulta más frecuente en Atención Primaria Médica (Coca A. 2005. Hipertensión. 112: 489-494; Andros V. 2005. Am J Manag Care. 11: S215-S219; Banegas JR, Rodríguez-Artalejo F, Rilope LM y col. 2002. J Hypertens. 20: 2157-2164; Suárez C, Gabriel R. 2000. Cardiovasc Risks Factors. 9: 239-246) . La Organización Mundial de la Salud considera que la HTA es la primera causa de muerte a escala planetaria (Ezzati M, López AD, Rodgers A y col. 2002. Lancet. 360: 1347-1360) .

Para prevenir incidentes sanitarios, la Guía Europea de Prevención Cardiovascular indica que es preciso mantener la presión arterial <140/90 mm Hg, pero estos valores límite deben reducirse en caso de pacientes con diabetes, enfermedad crónica renal, historial de ictus, enfermedad coronaria o fallo cardiaco o que manifiestan otros factores de riesgo cardiovascular (The Task Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society of Hypertension (ESH) and of the European Society of Cardiology (ESC) . 2007. J Hypertens. 25: 1105-1187; Brotons C, Royo Bordonada MA, �lvarez Sala L y col. 2004. Rev Esp Salud Pública. 78: 435-438) .

La estrategia farmacológica más común para tratar la HTA consiste en actuar sobre el sistema renina-angiotensinaaldosterona. Dicho sistema está implicado en el mantenimiento de los niveles de la presión arterial. La desregulación del sistema contribuye a incrementar la presión sanguínea y, de forma secundaria, induce daños sistémicos. Uno de los componentes más importantes de este sistema es la enzima convertidora de angiotensina (conocida como ACE, en sus siglas en inglés) . Esta enzima cataliza la hidrólisis de un decapéptido inactivo (angiotensina I) , con la producción de un octapéptido activo (angiotensina II) . La angiotensina II tiene un potente efecto vasoconstrictor. Adicionalmente, ACE cataboliza la bradikinina y elimina su efecto vasodilatador (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977. Science.

196: 441-444; Skeegs LT, Kahn JE, Shumway NP. 1956. J Exp Med. 103: 295-299) .

La reducción de la actividad de ACE tiene un efecto vasodilatador que contribuye a reducir la presión arterial. Dentro del arsenal terapéutico para el tratamiento de HTA se encuentran medicamentos con efecto inhibidor de ACE. Los inhibidores de ACE fueron introducidos en la década de los años ochenta con un éxito considerable para el tratamiento de HTA y sus complicaciones asociadas. La estructura molecular de estos medicamentos es muy similar; consisten en dipéptidos (como el captopril, que es el dipéptido Cys-Pro o CP) y tripéptidos. Se recomienda especialmente su uso en casos de HTA asociada con aterosclerosis asintomática, microalbuminuria y disfunción renal; cuando ha habido eventos previos de infarto de miocardio o fallo cardiaco y cuando los pacientes sufren HTA junto a estrés metabólico o diabetes mellitus (The Task Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society of Hypertension (ESH) and of the European Society of Cardiology (ESC) . 2007. J Hypertens. 25: 1105-1187) .

Además de los tratamientos farmacológicos recomendados para aquellas personas con HTA, es posible establecer medidas no farmacológicas que inciden fundamentalmente en el estilo de vida. Estas recomendaciones son válidas también para los normotensos con una presión arterial normal-alta e incluyen el control del peso corporal, la restricción del consumo de alcohol, café y sal, el aumento de la actividad física, un consumo abundante de frutas y verduras, el abandono del tabaco y la reducción del estrés (Icart MT, Pulpón AM, Icart MC y col. 2007. Hipertensión. 24: 48-53) .

Por otro lado, desde hace unos años ha surgido la posibilidad de utilizar péptidos con actividad inhibitoria...

1. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina caracterizado porque comprende:

a. hidrolizar leche de vacuno con una metaloendopeptidasa a una temperatura comprendida entre 30 y 705C y durante un tiempo comprendido entre 15 minutos y 5 horas,

b. finalizar la reacción de hidrólisis mediante la inactivación de la metaloendopeptidasa, y

c. obtener el extracto peptídico crudo resultado de la hidrólisis.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de hidrólisis se lleva a cabo durante un tiempo comprendido entre 15 y 60 minutos.

3. Procedimiento según la reivindicación1ó2, caracterizado porque la metaloendopeptidasa y la leche se mezclan en unas proporciones comprendidas entre 0.0001:1-0.00001:1.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la metaloendopeptidasa empleada es la termolisina.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el extracto peptídico crudo obtenido en c) presenta una actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina comprendida entre 6.000

12.000 Ul/ml y unos valores de IC50 comprendidos entr.

2. 30 μg/ml.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 caracterizado porque comprende adicionalmente un paso d) para enriquecer y/o concentrar el extracto peptídico crudo obtenido en c) .

7. Procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el paso d) se lleva a cabo mediante ultrafiltración con membranas hidrofílicas de 3.000 ó 10.000 Da.

8. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado porque el paso d) comprende adicionalmente una cromatografía de afinidad y/o cromatografía en fase inversa.

9. Extracto peptídico con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina obtenible por el procedimiento de las reivindicaciones 1-8.

10. Extracto peptídico, según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende al menos un péptido seleccionado de entre los péptidos de secuencia SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 63, SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 65, sus sales fisiológicamente aceptables y sus combinaciones.

11. Composición alimentaria caracterizada porque comprende un extracto peptídico según la reivindicación 9 ó

10.

12. Composición alimentaria, según la reivindicación 11, caracterizada porque el extracto peptídico está presente en una cantidad adecuada para reducir la hipertensión arterial en humanos o animales.

13. Composición alimentaria, según la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque su administración es en formato sólido o líquido.

14. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un extracto peptídico según la reivindicación 9 ó

10.

15. Composición farmacéutica, según la reivindicación 14, caracterizada porque el extracto peptídico está presente en una cantidad adecuada para reducir la hipertensión arterial en humanos o animales.

16. Composición farmacéutica, según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque su administración es de forma oral, parenteral, rectal, tópica o respiratoria y en formato sólido o líquido.

17. Extracto peptídico, según la reivindicación 9 ó 10, para su empleo en el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en humanos o animales.

18. Extracto peptídico, según la reivindicación 9 ó 10, para su empleo como medicamento.

19. Empleo de un extracto peptídico, según la reivindicación 9 ó 10, para la fabricación de un alimento, un ingrediente alimentario o un suplemento alimenticio para la reducción de la presión arterial en humanos o animales con hipertensión arterial.

20. Empleo de un extracto peptídico, según la reivindicación 9 ó 10, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en humanos o animales.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> GRUPO LECHE PASCUAL S.A.U.

<120> PROCEDIMIENTO ENZIMÃ?TICO PARA LA PRODUCCIÃ"N DE PEPTIDOS BIOACTIVOS

<130> 109/09

<160> 65

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 4 <210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 9 <210> 10

<211> 12

<121> PRT

<213> Bos taurus <400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 11

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 16

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 17

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 18 <210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 20

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 21

<210> 22

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 22

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 23 <210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 24

<210> 25

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 26

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<213> Bos taurus <400> 27

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 28

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 29

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 31

<210> 32

<211> 14

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 32

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 33

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 34

<210> 35

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<212> PRT

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<213> Bos taurus <400> 36

<210> 37

<211> 18

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<213> Bos taurus <400> 37

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<213> Bos taurus <400> 38

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 39

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<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 40

<210> 41

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 41

<210> 42

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 42

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 43

<210> 44

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 44 <210> 45

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 45

<210> 46

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<213> Bos taurus <400> 46

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<213> Bos taurus <400> 47

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 49

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<213> Bos taurus <400> 50

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<211> 13

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 51

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<211> 11

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<213> Bos taurus <400> 53

<210> 54

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<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 64

<210> 65

<211> 12

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 65

OFICINA ESPAÃ`OLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200930570

ESPAÃ`A

Fecha de presentación de la solicitud: 06.08.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

48. 503. Todo el documento, especialmente tablas 1, 4 y 5. 1-20 X OTTE, J. et al. “Fractionation and identification of ACE-inhibitor y peptides from a-lactalbumin and º-casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis”. INTERNATIONAL DAIRY JOURNAL. 2007. Vol. 17, páginas 1460-1472. Tablas 1 y 2. 10-20 X ES 2277468 A1 (GRUPO LECHE PASCUAL, S.A.) 01.07.2007, reivindicaciones 15-26, 34-36. 10-20 A ABUBAKAR, A. et al. “Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion”. JOURNAL OF DAIRY SCIENCE. 1998. Vol. 81, páginas 3131-3138. Todo el documento. 1-20 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe 28.02.2011 Examinador M. Novoa Sanjurjo Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÃCNICA

Nº de solicitud: 200930570

CLASIFICACIÃ"N OBJETO DE LA SOLICITUD

C12P21/06 (01.01.2006) A23L1/305 (01.01.2006) A23J3/34 (01.01.2006) A61K35/20 (01.01.2006) A61K38/55 (01.01.2006) A61P9/12 (01.01.2006)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C12P, A23L, A23J, A61K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, HCAPLUS

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÃ"N ESCRITA

Nº de solicitud: 200930570

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 01.03.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones:

La invención consiste en un procedimiento de obtención de un extracto peptídico que presenta actividad inhibidora de ECA (enzima convertidora de angiotensina) , obtenido al someter a hidrólisis con termolisina, leche de vaca a una temperatura comprendida entre 30ºC y 70ºC y un tiempo entre 15 mn y 5 h. La relación enzima:sustrato está comprendida entre 10-5-10

4:1 y se obtiene un extracto, en el que se identifica la presencia de 65 péptidos derivados de las proteínas de la leche, que presenta una actividad inhibidora de ECA entre 6.000 y 12.000 UI/ml y una IC50 comprendida entre 25 y 30 !g/ml.

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OPINIÃ"N ESCRITA

Nº de solicitud: 200930570

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

48. 503. Todo el documento, especialmente tablas 1, 4 y 5. D02 OTTE, J. et al. “Fractionation and identification of ACE-inhibitor y peptides from a-lactalbumin and -casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis”. INTERNATIONAL DAIRY JOURNAL. 2007. Vol. 17, páginas 1460-1472. Tablas 1 y 2. D03 ES 2277468 A1 (GRUPO LECHE PASCUAL, S.A.) 01.07.2007 D04 ABUBAKAR, A. et al. “Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion”. JOURNAL OF DAIRY SCIENCE. 1998. Vol. 81, páginas 3131-3138. Todo el documento.

El documento D01, describe la hidrólisis de las proteínas de la leche con termolisina. Los ensayos se realizaron por separado con 9 sustratos que contienen todas las proteínas de la leche. La hidrólisis se realizó a pH 8 con termolisina y la relación enzima:sustrato fue 1:100 en peso. La mayor actividad inhibidora de los péptidos obtenidos, se obtuvo a las 3 horas de hidrólisis. No se proporciona el dato de la actividad específica de la enzima utilizada. El documento presenta resultados sobre los péptidos obtenidos por la hidrólisis, que presentan actividad inhibidora de ECA. Alguno de los péptidos obtenidos coincide con los péptidos identificados en el extracto de la presente solicitud. El documento D02, describe la identificación de péptidos con actividad ECA obtenidos por hidrólisis de a-lactalbúmina y caseina con termolisina. Alguno de los péptidos coincide con los péptidos de la invención. El documento D03, describe la obtención de péptidos con actividad antihipertensiva obtenidos por fermentación de leche con cepas de Enterococcus faecalis. Las secuencias de los péptidos coinciden con algunos de los péptidos del hidrolizado de la invención. El documento D04, describe también la hidrólisis de suero de queso hidrolizado con distintas enzimas entre las que se encuentra termolisina. Alguno de los péptidos obtenidos por hidrólisis con proteinasa K y que presentan actividad inhibidora de ECA, comparten parte de la secuencia con algunos de los péptidos identificados en el extracto de la invención.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA Reivindicaciones 1-10 La hidrólisis de las proteínas de la leche con la enzima termolisina para producir péptidos con actividad ECA es conocida en el estado de la técnica. La termolisina es activa en temperaturas comprendidas entre 30 y 70 ºC y la mayor actividad ECA se consigue en la primera hora de hidrólisis. En el documento D01, se realiza la hidrólisis de las proteínas de la leche en las condiciones óptimas de actuación de la termolisina conocidas en el estado de la técnica. La relación enzima:sustrato es diferente que en el procedimiento de la solicitud, pero no puede valorarse la diferencia porque no se aportan datos de la actividad específica de la enzima utilizada que en los dos ensayos comparados pertenecen a casas comerciales diferentes. Se aporta la IC50 del extracto completo, pero no la IC50 individual de los 65 péptidos identificados en el mismo. Podría darse el caso de que algunos de los péptidos identificados no tenga ninguna actividad ECA y que sin embargo exista en el extracto algún péptido no identificado, derivado de alguno de los anteriores que si tenga fuerte actividad y que forme parte de los péptidos derivados de la leche que ya forman parte del estado de la técnica como los descritos en los documentos D01-D03. Por tanto, las reivindicaciones 1-20, no cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva de acuerdo a los Art. 6 y 8 de la LP. Reivindicaciones 11-20 Las composiciones alimentarias y farmacéuticas que contienen extractos peptídicos obtenidos por hidrólisis enzimática a partir de proteínas de la leche y que presentan actividad ECA, son conocidos en el estado de la técnica. El documento D03, describe el uso de un extracto que contiene alguno de los péptidos del extracto de la invención, para preparar composiciones alimentarias que tienen capacidad para reducir la tensión arterial en las personas que las consumen. Las reivindicaciones 11-20, no cumplen requisitos de novedad y actividad inventiva de acuerdo a los Art. 6 y 8 de la LP.

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