PROCEDIMIENTO DIRECTO DE DETECCION ESPECIFICA DEL VIROIDE PEACH LATENT MOSAIC VIROID MEDIANTE DIANAS INMOVILIZADAS Y RT-PCR A TIEMPO REAL Y KIT PARA SU DETECCION.
Se detalla un procedimiento de preparación, conservación y análisis de muestras de material vegetal para diagnóstico y detección mediante amplificación molecular basada en RT-PCR a tiempo real.
El procedimiento se ha aplicado a detección de Peach latent mosaic viroid. Las muestras son inmovilizadas en soportes de papel o nylon, mediante impresión de tejidos o de sus secciones o absorbidas en papel o nylon cuando se trata de muestras líquidas. Las muestras inmovilizadas, pueden ser conservadas a temperatura ambiente. El protocolo de análisis comienza por la extracción de dianas del soporte con agua destilada, octoxinol o tampón glicina y posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Se detallan las secuencias de nucleótidos de iniciadores de amplificación molecular y sonda TaqMan, en que se basa el kit de detección.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201101135.
Solicitante: INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS (IVIA).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: CAMBRA ALVAREZ,MARIANO, BERTOLINI,EDSON, DURAN VILA,NURIA, SERRA ALFONSO,Pedro, LÓPEZ GONZÁLEZ,María Milagros, LOPES,Silvio, AYRES,Juliano, BOVÉ,Joseph.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/70 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
PDF original: ES-2386131_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona en general con la detección de material genético (secuencias de ácidos nucleicos) mediante el empleo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, y en particular con la preparación previa de las muestras y su conservación, antes de realizar RT-PCR cuantitativa a tiempo real. El procedimiento comprende la inmovilización directa, conservación y extracción de las dianas de interés para su amplificación molecular por RT-PCR a tiempo real. La invención, por tanto, se relaciona con: 1) un procedimiento de preparación directa de muestras mediante inmovilización en membranas de papel o nylon por impresión o escachado de material vegetal, 2) un procedimiento para analizar extractos brutos de muestras de material vegetal o RNA purificado, inmovilizado en soportes sólidos, 3) un método de conservación de las membranas conteniendo muestras de cualquier tipo, 4) un sistema de extracción de dianas sin purificación de ácidos nucleicos y 5) unas secuencias de nucleótidos de iniciadores y sondas TaqMan específicas, para el diagnóstico y detección universal de Peach latent mosaic viro id (PLMV d) , de cualquier origen o huésped, mediante un kit basado en todo lo anterior.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La patente ES 2 110 916 de 25 de mayo de 1996, de la cual fue solicitante el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) e inventores Mariano Cambra
Álvarez, Antonio Olmos Castelló y Miguel Ángel Dasi Rodríguez, describe un procedimiento de preparación de dianas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Esta patente ha sido mantenida por IVIA hasta la fecha. En la actualidad, se han realizado nuevas aplicaciones y modificado el procedimiento inicialmente descrito en 5 la patente y posteriormente por Olmos et al., 1996 (Nucleic Acids Res. 24, 2192-2193) , para simplificarlo y poderlo aplicar a agentes patógenos no ensayados todavía y muy problemáticos en su detección, como bacterias Gram negativas no cultivables in vitro (limitadas al floema o al xilema de plantas y a artrópodos) y a viroides (agentes patógenos o replicones infecciosos carentes de proteína de cubierta) . 1O El procedimiento de inmovilización de dianas en soportes sólidos (membranas) , su extracción y análisis mediante PCR o RT-PCR a tiempo real, sólo se ha aplicado a la detección de virus en material vegetal y en artrópodos (Olmos et al., 2005. J. Virol. Methods 128, 151-155; Cambra et al., 2006. In:Virus Diseases and Crop Biosecurity, Ed. NATO-Security trough Science. Series C. Springer. 81-88pp.; Osman y 15 Rowhani, 2006. J. Virol. Methods 133, 130-136; Olmos et al., 2007. In: Biotechnology and plant diseases management. CABI Press, British Columbia. 227-249pp.; Bertolini et al., 2008. Eur. J. Plant Pathol. 120, 177-188; López et al., 2009. Curr. Issues Mol. Biol. 11, 1346; Capote et al. 2009. Int. Microbio!. 12, 1-6; Bertolini et al., 2010. Eur. J. Plant Pathol.128, 283-287. El procedimiento no ha sido descrito a viroides, ya que estos 20 organismos fitopatógenos presentan concentraciones estacionales mínimas en la planta y distribución o repartición irregular en los tejidos del hospedador. La detección fiable de estos organismos, muchos de ellos clasificados como de cuarentena, hace necesario el desarrollo de técnicas y protocolos extremadamente sensibles y específicos para su detección y diagnóstico y que puedan ser empleados en gran escala de una forma sencilla. 25 Además, la invención permite la conservación y el uso de controles inmovilizados sin riesgos de escapes. Los viroides son moléculas de RNA monocatenario, covalentemente cerradas, sin capacidad codificante, pero capaces de replicarse de forma autónoma utilizando la maquinaria transcripcional de las células a las que parasitan. Estos constituyen la forma 30 más extrema de parasitismo en el mundo vegetal. Los viroides son los entes biológicos más simples descritos hasta el momento (Flores y Duran, 1996. In: Patología vegetal. Tomo l. SEF-Phytoma España. 149-183) . Poseen propiedades estructurales, funcionales yevolutivas propias. El tamaño de los viroides oscila entre 246 y 399 nucleótidos, correspondientes respectivamente al viroide del "Cadang-cadang" (Coconut cadangcadang viro id, CCCV d) del cocotero y al viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chr y santhemun chlorotic mottle viroid, CChMVd) (Flores et al., 2003. In: Viroids. CSIRO Publishing, Collingwood. 224-227) .
PLMVd pertenece al género Pelamoviroid dentro de la familia Avsunviroidae (Flores et al., 2000. Viroids. In: Virus Taxonomy, 7th report of the Intemational Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press. San Diego, CA) . Produce enfermedades económicamente importantes ya que afecta la calidad de fruto provocando decoloraciones y malformaciones en frutos de melocotonero. El viroide está presente en la mayoría de países productores de frutales de hueso. Una detallada descripción de sus síntomas y características moleculares ha sido publicada por Flores et al., 1990. (Research in Virology 141, 109-118) y Cambra et al., 20008. (Viruses and Viroids ofPeach Trees. In: The Peach, Botany, Productions and uses. CAB Intemational, London) .
Los métodos de detección de viroides se basan principalmente en técnicas biológicas, bioquímicas, moleculares o en combinación de las mismas. Los viroides no posen envoltorio proteico, haciendo imposible el uso de métodos inmunológicos utilizados normalmente para la detección de virus. Las pruebas biológicas son únicamente utilizadas para detección de CEV d y otros viroides de los cítricos. Los métodos bioquímicos se basan en la realización de electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (sPAGE) (Semancik y Harper. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4429-4433) que permite distinguir los viroides presentes en un aislado por su movilidad electroforética. Para la detección molecular es importante considerar que el material genético de los viroides es RNA de cadena sencilla, circular y fuertemente estructurado. Entre los métodos moleculares de detección de viroides figura la hibridación molecular con sondas radiactivas o marcadas con digoxigenina (Flores. 1988. Proc. 10th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, 192-196; Podleckis et al., 1993. J. Virol. Methods 43, 147-158) . Una interesante versión de la hibridación molecular combinada con la realización de impresiones de material vegetal fue descrita por Palacio-Bielsa et al. (1999) . Eur. J. Plant Pathol. 105, 897-903. En este método se combinan técnicas biológicas de amplificación de la población de viroides en huéspedes apropiados previa a la realización de impresiones de secciones de tejido vegetal en membranas y su posterior hibridación con sondas específicas. También se ha descrito un
sistema de hibridación "northem" con sondas marcadas con digoxigenina que permite detectar viroides en extractos de muestras de campo (Murcia et al., 2009. Mol. Cell Probes 23, 95-1 02) . No obstante, todos estos métodos moleculares o híbridos poseen escasa sensibilidad y frecuentemente son muy laboriosos limitando el número de muestras que 5 pueden ser procesadas por operario y día. La puesta a punto de la RT-PCR y su aplicación a la detección de viroides ha permitido incrementar la sensibilidad, aunque la detección rutinaria mediante esta técnica no se ha popularizado por problemas de inhibiciones que inducen falsos negativos y amplificaciones inespecíficas (Gamsey et al., 2002. Proc. 15th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, 219-229) . Además, la RT-PCR convencional posee 1O altos riesgos de contaminación (falsos positivos) (Olmos et al., 2007. In: Molecular diagnostic methods for plant viruses. CABI Press, London. 227-249; López et al., 2009) . La aplicación de R T-PCR a tiempo real a la detección de viroides está en su etapa inicial, de hecho únicamente se han publicado tres trabajos, del mismo grupo de investigación, aplicados a PSTVd (Boonham et al., 2004. J. Virol. Methods 116, 139-146; OEPPIEPPO, 15 2004, y Monger et al., 2010. J. Virol. Methods doi: 10.1016/j.jviromet.2010.07.002) . Para el método propuesto se utiliza RNA purificado que complica y encarece el coste de la detección y limita el número de muestras procesables diariamente por un operario. La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de muestras de frutales de hueso para su uso directo, mediante un kit basado en R T-PCR a 20 tiempo real, su conservación por largos periodos antes del análisis o como controles y su análisis directo tras una sencilla extracción de las dianas del viroide PLMV d directamente inmovilizadas en soportes sólidos. DESCRIPCIÓN DE LA... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1a. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, caracterizado porque comprende las etapas de: i) Inmovilización de las dianas para RT-PCR a tiempo real de muestras vegetales, en un soporte sólido, y ii) Extracción de las dianas para RT-PCR a tiempo real con agua destilada o un agente capaz de solubilizar dichas dianas.
2a. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación P, caracterizado porque en la conservación de las dianas inmovilizadas permite largos periodos de almacenamiento y su envío por correo para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real.
3a. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque se emplea para analizar sistemáticamente por RT-PCR a tiempo real, dianas inmovilizadas y conservadas en tubos Eppendorf o en pocillos de placas ELISA.
4a. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1\ caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PLMV d la secuencia (SEQ ID N° 1) de 22 nucleótidos (posició.
14. 163) de la secuencia de Peach latent mosaic viroid (GenBank n° GI291165198) , denominada PLMV df.
sa. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso para la amplificación por R T-PCR a tiempo real del viroide PLMV d la secuencia (SEQ ID N° 2) de 18 nucleótidos (complementaria a la posició.
19. 216) de la secuencia de Peach latent mosaic viroid (GenBank no GI291165198) , denominada PLMVdr.
6a. Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PLMVd la secuencia (SEQ ID N° 3) de 20 nucleótidos (posició.
17. 192) de la secuencia de Peach Latent mosaic viroid (GenBank no GI291165198) , denominada PLMVdp.
7a__ Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de dichas secuencias para la fabricación de un kit completo de diagnóstico, detección, identificación o caracterización de PLMV d u otros del género Avsunviroidae.
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