Se detalla un procedimiento de preparación, conservación y análisis de muestras de material vegetal para diagnóstico y detección mediante amplificación molecular basada en RT-PCR a tiempo real.

El procedimiento se ha aplicado a detección de los pospiviroides Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid. Las muestras son inmovilizadas en soportes de papel o nylon, mediante impresión de tejidos o de sus secciones o absorbidas en papel o nylon cuando se trata de muestras líquidas. Las muestras inmovilizadas, pueden ser conservadas a temperatura ambiente. El protocolo de análisis comienza por la extracción de dianas del soporte con agua destilada, octoxinol o tampón glicina y posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Se detallan las secuencias de nucleótidos de iniciadores de amplificación molecular y sondas TaqMan en las que se basa el kit de detección.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona en general con la detección de material genético (secuencias de ácidos nucleicos) mediante el empleo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, y en particular con la preparación previa de las muestras y su conservación, antes de realizar RT-PCR cuantitativa a tiempo real. El procedimiento comprende la inmovilización directa, conservación y extracción de las dianas de interés para su amplificación molecular por RT-PCR a tiempo real. La invención, por tanto, se relaciona con: 1) un procedimiento de preparación directa de muestras mediante inmovilización en membranas de papel o nylon por impresión o escachado de material vegetal 2) un procedimiento para analizar extractos brutos de muestras de material vegetal

o RNA purificado, inmovilizado en soportes sólidos, 3) un método de conservación de las membranas conteniendo muestras de cualquier tipo, 4) un sistema de extracción de dianas sin purificación de ácidos nuc1eicos y 5) unas secuencias de nucleótidos de iniciadores y sondas TaqMan específicas, para el diagnóstico y detección universal de Po tato spindle tuber viro id (PSTVd) y Citrus exocortis viroid (CEVd) de cualquier origen o huésped, mediante un kit basado en todo lo anterior.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La patente ES 2 110 916 de 25 de mayo de 1996, de la cual fue solicitante el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (lVIA) e inventores Mariano Cambra Álvarez, Antonio Olmos Castelló y Miguel Ángel Dasi Rodríguez, describe un procedimiento de preparación de dianas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Esta patente ha sido mantenida por IVIA hasta la fecha. En la actualidad, se han realizado nuevas aplicaciones y modificado el procedimiento inicialmente descrito en la patente y posteriormente por Olmos el al., 1996 (Nucleic Acids Res. 24, 2192-2193) , para simplificarlo y poderlo aplicar a agentes patógenos no ensayados todavía y muy problemáticos en su detección, como los viroides (agentes patógenos o replicones infecciosos carentes de proteína de cubierta) .

El procedimiento de inmovilización de dianas en soportes sólidos (membranas) , su extracción y análisis mediante RT-PCR a tiempo real, sólo se ha aplicado a la detección de virus en material vegetal y en artrópodos (Olmos el al., 2005. J. Virol. Methods 128, 151-155; Cambra el al., 2006. In:Virus Diseases and Crop Biosecurity, Ed. NATO-Security trough Science. Series C. Springer. 81-88pp.; Osman y Rowhani, 2006. J. Virol. Methods 133, 130-136; Olmos el al., 2007. In: Biotechnology and plant diseases management. CABI Press, British Columbia. 227-249pp.; Bertolini el al., 2008. Eur. J. Plant Pathol. 120, 177-188; López el al., 2009. Curro Issues Mol. Biol. 11, 13-46; Capote el al. 2009. Int. Microbiol. 12, 1-6; Bertolini el al., 2010. Eur. J. Plant Pathol. 128, 283-287. El procedimiento no ha sido descrito para detección de viroides, ya que estos organismos fitopatógenos presentan concentraciones estacionales mínimas en la planta y distribución o repartición irregular en los tejidos del hospedador. La detección fiable de estos organismos, algunos de ellos clasificados como de cuarentena, hace necesario el desarrollo de técnicas y protocolos extremadamente sensibles y específicos para su detección y diagnóstico y que puedan ser empleados en gran escala de una forma sencilla. Además, la invención permite la conservación y el uso de controles inmovilizados sin riesgos de escapes.

Los viroides son moléculas de RNA monocatenario, covalentemente cerradas, sin capacidad codificante, pero capaces de replicarse de forma autónoma utilizando la maquinaria transcripcional de las células a las que parasitan. Estos constituyen la forma más extrema de parasitismo en el mundo vegetal. Los viroides son los entes biológicos más

simples descritos hasta el momento (Flores y Duran, 1996. In: Patología vegetal. Tomo 1. SEF-Phytoma España. 149-183) . Poseen propiedades estructurales, funcionales y evolutivas propias. El tamaño de los viroides oscila entre 246 y 399 nucleótidos, correspondientes respectivamente al viroide del "Cadang-cadang" (Coconut cadangcadang viro id, CCCVd) del cocotero y al viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chr y santhemun chlorotic mottle viro id, CChMVd) (Flores et al., 2003. In: Viroids. CSIRO Publishing, Collingwood. 224-227) .

La familia Pospiviroidae, comprende cinco géneros que incluyen al género Pospiviroide que contiene, hasta el momento, nueve especies: Potato spindle tuber viroid (PSTV d) (especie tipo) , Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDV d) , Mexican papila viroid (MPV d) , Tomato planta macho viro id (TPMV d) , Chr y santhemum stunt viro id (CSV d) , Tomato apical stunt viro id (TASV d) , Iresine viroid (IrV d) , Columnea latent viro id (CL Vd) y Cilrus exocortis viroid (CEV d) . Los viroides PSTV d y CEV d son objeto de esta patente de invención por ser los de mayor repercusión económica en los cultivos de patata y cítricos, respectivamente.

PSTV d causa la enfermedad del ahusado o tubérculos fusiformes de la patata (Solanum tuberosum) , enfermedad que causa cuantiosas pérdidas económicas en dicho cultivo por lo cual se considera de cuarentena en la legislación europea (EU Annex l/Al, EPPO A2) y en la de otros países. Este viroide posee una considerable estructura secundaria y en patata normalmente posee un tamaño de 359 nucleótidos. Es el único viroide conocido que infecta naturalmente a especies cultivadas de patata, aunque se ha encontrado MPV d en S. cardiophyllum (papita guera o cimantli) . PSTV d es muy polífago pudiendo parasitar a 94 especies de 31 familias, pero su principal hospedador son especies de solanáceas de diversos géneros (Solanum, Brugmansia, Datura, entre otros) .

CEV d causa la enfermedad de la exocortis de los cítricos, aunque puede parasitar a plantas de interés económico de muy diversas familias botánicas, siendo la mayoría de ellas portadores asintomáticos. No obstante, CEVd es limitante del uso de patrones tolerantes al síndrome de tristeza causado por Citrus tristeza virus (CTV) , ya que son muy sensibles al viroide que induce descamación de la corteza, enanismo y disminución del rendimiento en cosecha. CEVd está distribuido en la mayoría de los países

citrícolas y las pérdidas económicas son variables y dependen de la estirpe del patógeno, la edad del árbol en el momento que tiene lugar la infección y las condiciones climáticas de la zona. Para una citricultura moderna es imprescindible disponer de cultivares y patrones libres de CEV d y de otros viroides de los cítricos (Duran; 2000. In: Enfermedades de los cítricos, SEF, Mundi Prensa, 87-92) . El tamaño de su genoma oscila entre 370-375 nucleótidos y presenta numerosas variantes de secuencia.

Los métodos de detección de viroides se basan principalmente en técnicas biológicas, bioquímicas, moleculares o en combinación de las mismas. Los viroides no posen envoltorio proteico, haciendo imposible el uso de métodos inmunológicos utilizados normalmente para la detección de virus. Se han publicado protocolos internacionales para diagnóstico de PSTVd (OEPPIEPPO, 2004. Bull OEPPIEPPO Bull 34, 155-157) . Las pruebas biológicas son únicamente utilizadas para detección de CEV d y otros viroides de los cítricos y consisten en la inoculación de plantas indicadoras de cidro Etrog (Roistacher. 1991) , pero estos métodos no son específicos y por tanto no permiten distinguir entre viroides (Duran-Vila y Semancik, 1990. Ann. App!. Bio!. 17, 367-377) , además son lentos y caros. Los métodos bioquímicos se basan en la realización de electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (sPAGE) (Semancik y Harper. 1984. Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 81, 4429-4433) que permite distinguir los viroides presentes en un aislado por su movilidad electroforética. Para la detección molecular es importante considerar que el material genético de los viroides es RNA de cadena sencilla, circular y fuertemente estructurado. Entre los métodos moleculares de detección de viroides figura la hibridación molecular con sondas radiactivas o marcadas con digoxigenina (Flores. 1988. Proc. 10th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, 192-196; Podleckis et al., 1993. J. Virol. Methods 43, 147-158) . Una interesante versión de la hibridación molecular combinada con la realización de impresiones de material vegetal fue descrita por Palacio-Bielsa et al. (1999) . Eur. J. Plant Pathol. 105, 897-903. En este método se combinan técnicas biológicas de amplificación de... [Seguir leyendo]

1a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viro id mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, caracterizado porque comprende las etapas de: i) Inmovilización de las dianas para RTPCR a tiempo real de muestras vegetales en un soporte sólido, y ii) Extracción de las dianas para RT-PCR a tiempo real con agua destilada o un agente capaz de solubilizar dichas dianas.

2a ._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1a, caracterizado porque en la conservación de las dianas inmovilizadas permite largos periodos de almacenamiento y su envío por correo para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real.

3a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque se emplea para analizar sistemáticamente por RT-PCR a tiempo real, dianas inmovilizadas y conservadas en tubos Eppendorf o en pocillos de placas ELISA.

4a. Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación ¡a, caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd. la secuencia (SEQ ID N° 1) de 19 nucleótidos (posició.

33. 356) de la secuencia de Po tato spindle tuber viro id (GenBank n° GU481090.1) , denominada PSTVdf.

7a._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real,

según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd. la secuencia (SEQ ID N° 2) de 16 nucleótidos (complementaria a la posició.

8. 102) de la secuencia de Po tato spindle tuber viroid-PSTVd (GenBank nO GU481090.1) , denominada PSTVdr.

8a ._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viro id mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1 a, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PSTVd la secuencia (SEQ ID N° 3) de 27 nucleótidos (posición 19-45) de la secuencia de Potato spindle tuber viroid-PSTVd (GenBank n° GU481090.1) , denominada PSTVdp.

9a ._ Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1a, caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N° 4) de 20 nucleótidos (posició.

34. 366) de la secuencia de Citrus exocortis viroid-CEVd (GenBank nO FJ904293.1) , denominada CEVdf.

lOa._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación ¡a, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N° 5) de 18 nucleótidos (complementaria a la posició.

8. 97) de la secuencia de Citrus exocortis viroid-CEVd (GenBank nO FJ904293.1) , denominada CEVdr.

11a._ Procedimiento directo de detección específica de Potato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación ¡a, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide CEVd la secuencia (SEQ ID N° 6) de 28 nucleótidos

(posició.

37. 26) de la secuenCIa de Citrus exocortis viroid-CEVd (GenBank nO FJ904293.1) , denominada CEVdp.

3 . Procedimiento directo de detección específica de Po tato spindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de dichas secuencias para la fabricación de un kit completo de diagnóstico, detección, identificación o caracterización de los viroides PSTV d y CEV d u otros del mismo género Pospiviroide.

ES 2 387 172 Al

Figura 1

0.1

~ 0.001

0.0001

0.00001

0.000001

~~M •• »»~»»» •• »».4 ••

CycIt

Figura 2

ES 2 387 172 Al

0, 1

0, 01

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0, 001

0, 0001

0, 00001

2 • a I ~ a u M M Z ~ ~ ~ a ~ » ~ ~ • e G ~

Cycle

Figura 3

Lista de Secuencias

<110> Instituto valenciano de Investigaciones Agrarias

<120> procedimiento directo de detección específica de los viroides potatospindle tuber viroid y Citrus exocortis viroid mediante dianas inmovilizadas yRT-PCR a tiempo real y kit para su detección

<160> 6

<170> BissAP 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1. .19

<223> /mol_tr, pe="DNA"/note='Forward primer pSTVdf"/organism="Artificial sequence"

<400> 1 ccttggaacc gcagttggt 19

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequen ce

<220>

<221> source

<222> 1. .16

<223> /mol_tvpe="DNA"/note=f'Reverse Primer PSTVd R" /organism="Artificial sequence"

<400> 2

tttccccggg gatccc 16

<210> 3

<211> 27

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<213> Artificial sequence

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<221> source

<222> 1..27

<223> /mol_tvpe="DNA" /note=f'probe PsTVd p"/organism="Artificial sequence"

<400> 3 tcctgtggtt cacacctgac ctcctga

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifi ci al sequence

<220>

<221> source

<222> 1. .20