Preparación y xenotrasplante de islotes de cerdo.

Un método de preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables,

capaces de producir tras el xenotrasplanteinsulina de cerdo en un receptor mamífero apropiado, incluyendo o comprendiendo el método:

(i) la obtención del páncreas de lechones que se encuentran a entre -20 y +20 días de su gestación completa, y

(ii) la extracción de islotes procedentes de un cultivo de los páncreas obtenidos utilizando una colagenasa adecuada,siendo el cultivo de los páncreas obtenidos:

a) de páncreas obtenidos y reducidos mecánicamente, y

b) una albúmina de mamífero de soporte sustancialmente exenta de agentes microbianos no humanos,en el que los páncreas y/o los islotes se someten al agente protector contra traumatismos lignocaína, y en el que losislotes se mezclan y/o se co-cultivan con células de Sertoli.

Preparación y xenotrasplante de islotes de cerdo

La presente invención se refiere a mejoras en el tratamiento y/o relacionadas con el tratamiento de la diabetes utilizando xenotrasplante. Más en particular, pero no exclusivamente, la presente invención se refiere a la preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables viables y/o al tratamiento de un paciente mamífero (incluyendo seres humanos) que padece diabetes, lo que supone el trasplante al mamífero de islotes de cerdo viables capaces de producir insulina en el hospedador y el uso asociado de células de Sertoli en el procedimiento.

Antecedentes

La diabetes mellitus de tipo 1 (dependiente de insulina) es un trastorno endocrino habitual que produce una morbilidad y una mortalidad sustanciales, y genera costes económicos considerables a pacientes individuales y

sistemas de salud pública.

El tratamiento con insulina, aunque sirve para salvar vidas, a menudo no proporciona un control suficiente de la glucosa en sangre para evitar las temidas complicaciones de la enfermedad, lo que ha impulsado investigaciones intensivas respecto a mejores métodos para mantener la normoglucemia.

Entre las estrategias de tratamiento más recientes que se han propuesto, la que ha recibido una mayor atención a nivel mundial es el trasplante de células de los islotes pancreáticos, obtenidos de otros seres humanos o de animales. Esto es debido a que el trasplante puede restaurar no sólo las unidades secretoras de insulina, sino también el ajuste preciso y fino de la liberación de insulina en respuesta a múltiples señales neurales y humorales

que aparecen dentro y fuera de los islotes de Langerhans.

El trasplante de células humanas de los islotes está limitado por la escasez de tejido humano de los islotes. Actualmente, el uso de células de los islotes de cerdo se contempla como la alternativa más prometedora puesto que:

I. el suministro de células de cerdo se puede expandir rápidamente optimizando el suministro de animales donantes;

II. la insulina de cerdo y la insulina humana presentan enormes similitudes estructurales; y

III. los niveles fisiológicos de glucosa en cerdos son similares a los de los humanos.

La justificación de este enfoque en el tratamiento (denominado "xenotrasplante") es que los islotes de cerdo implantados tienen el potencial de mimetizar la respuesta fisiológica normal de la insulina en diabéticos de tipo 1, de manera que se pueden conseguir niveles de glucosa en sangre cercanos a la normalidad sin la administración de insulina o con un requerimiento reducido. Como consecuencia, se pueden evitar las complicaciones a largo plazo de la diabetes y los pacientes experimentarán una menor hipoglucemia de la que padecen con los regímenes de insulina "intensivos" recomendados actualmente.

El aloinjerto (trasplante dentro de la misma especie) de islotes pancreáticos, separados de los órganos de donantes

45 humanos, podría inducir a la remisión completa de la hiperglucemia y a la interrupción del tratamiento con insulina exógena en pacientes con diabetes mellitus de tipo 1. No obstante, el éxito completo de este enfoque aún se ve obstaculizado por varios problemas, y en particular:

a) la desconexión de los islotes del páncreas nativo interrumpe una vasculatura neuro- y micro-capilar fina, así como una red reguladora humoral que podría provocar isquemia, apoptosis y liberación de mediadores de la reacción inflamatoria;

b) los islotes aislados son muy vulnerables a condiciones inmunológicas y ambientales adversas.

55 A pesar de que el rechazo inmunitario es un problema importante para el trasplante, problemas con la longevidad del trasplante de los islotes no relacionados con el sistema inmunitario también pueden impedir un trasplante con éxito de células de los islotes. Esto se puede adscribir a condiciones ambientales locales desfavorables debido a la naturaleza heterotópica de la anatomía del sitio del trasplante (normalmente el hígado) que difiere enormemente del páncreas nativo, a mediadores no específicos de la inflamación, apoptosis inducida por células, u otros factores desconocidos. Sin embargo, la renovación celular extremadamente lenta contribuye significativamente a acortar la vida útil funcional de ese tejido diferenciado. Por tanto se deberían llevar a cabo intentos para expandir la masa celular injertada original.

Estudios previos que informan sobre la inducción de la liberación de insulina a partir de islotes completos, que

65 habían sido expuestos a hormonas, tales como la prolactina, lactógeno placentario humano, y hormonas del crecimiento, no han conseguido demostrar un incremento significativo en la tasa de replicación celular de los islotes1, difuminando así la interpretación sobre el origen y los mecanismos de la secreción incrementada de insulina. En estudios posteriores, se demostró que las células de los islotes de seres humanos adultos se expandían durante el mantenimiento de un cultivo in vitro, en matrices especiales de tejido artificial, y en presencia de factores de crecimiento2. No obstante, en este caso particular, los islotes habían sido dispersados para formar células aisladas y

habían sido cultivados como monocapas celulares. Además, no había una correlación significativa entre el aumento del índice mitótico celular y el incremento en la concentración de insulina. Por último, aún resulta impredecible el impacto sobre el trasplante de los agregados de células de los islotes, antes que de los islotes completos, y no se ha seguido investigando.

En trabajo previo, particularmente como se detalla en el documento PCT/NZ01/0009 hemos descrito la preparación y uso de islotes de cerdo xenotrasplantables para el tratamiento de la diabetes.

Selawr y y col. (Cell Transplant; 5: 517-524 (1996) ) describe defectos inducidos por células de Sertoli sobre las características funcionales y estructurales de islotes aislados de cerdo neonatal. El documento de EE.UU. 5.849.285 15 describe el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria con células de Sertoli y el co-cultivo in vitro de células de mamífero con células de Sertoli.

Objeto

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado de preparación de islotes de cerdo que produzca islotes viables para el xenotrasplante en un paciente mamífero que sean capaces de producir insulina en el hospedador mamífero, así como la preparación de los islotes así producidos, o independientemente de cómo se hayan obtenido, o de una forma similar.

Alternativa o adicionalmente, es otro objeto proporcionar un método mejorado para el tratamiento de un paciente mamífero que padece diabetes lo que supone el xenotrasplante de islotes de cerdo al paciente mamífero.

Alternativa o adicionalmente, es otro objeto al menos proporcionar a la comunidad pública o médica un enfoque alternativo útil al tratamiento de la diabetes. 30

Declaraciones de la invención

En un primer aspecto la invención consta de un método para la preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables capaces de producir tras el xenotrasplante insulina de cerdo en un receptor mamífero apropiado, el método que 35 incluye o comprende:

(i) la obtención del páncreas de lechones al final o cerca de su gestación completa, y

(ii) la extracción de los islotes procedentes de un cultivo de los páncreas obtenidos utilizando una colagenasa 40 adecuada,

(iii) siendo el cultivo de los páncreas obtenidos:

a) de páncreas obtenidos y reducidos mecánicamente, y

45 b) una albúmina de mamífero de soporte sustancialmente exenta de agentes microbianos no humanos, en donde los páncreas y/o los islotes se someten al agente protector contra traumatismos lignocaína, y donde los islotes se mezclan y/o se co-cultivan con células de Sertoli.

50 Preferentemente, los islotes (al menos en alguna fase durante el desarrollo del método) se exponen a nicotinamida.

Los lechones se encuentran a entre -20 y +20 días de su gestación completa.

Preferentemente lechones se encuentran a entre -7 y +10 días de su gestación completa. 55 Preferentemente, la albúmina de mamífero es... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables, capaces de producir tras el xenotrasplante

insulina de cerdo en un receptor mamífero apropiado, incluyendo o comprendiendo el método: 5

(i) la obtención del páncreas de lechones que se encuentran a entre -20 y +20 días de su gestación completa, y

(ii) la extracción de islotes procedentes de un cultivo de los páncreas obtenidos utilizando una colagenasa adecuada,

siendo el cultivo de los páncreas obtenidos:

a) de páncreas obtenidos y reducidos mecánicamente, y

b) una albúmina de mamífero de soporte sustancialmente exenta de agentes microbianos no humanos,

en el que los páncreas y/o los islotes se someten al agente protector contra traumatismos lignocaína, y en el que los islotes se mezclan y/o se co-cultivan con células de Sertoli.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que:

(a) los islotes (al menos en alguna fase durante el desarrollo del método) se exponen a nicotinamida;

(b) la albúmina de mamífero es seroalbúmina humana (HSA) ; y/o 25 (c) la colagenasa se selecciona entre Liberase® humana y Liberase® porcina.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los lechones se encuentran a entre -7 y +10 días de su gestación completa.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha Liberase® es Liberase® humana.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los islotes se tratan con

nicotinamida después de su extracción del páncreas. 35

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método incluye una etapa adicional de tratar los islotes con IGF-1 o el tripéptido N-terminal del IGF-1 (GPE) .

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la preparación o el aislamiento de las células de Sertoli incluye el uso de, o la exposición a, un tampón para reducir selectivamente las células germinales.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el tampón es clorhidrato de tris- (hidroximetil) -aminometano.

45 9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación empleada de células de Sertoli a islotes es sustancialmente de 10-1000 células de Sertoli/islote.

10. Una preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables preparados según el método de una o más de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un dispositivo implantable que comprende la preparación de islotes de cerdo según la reivindicación 10.

12. Un dispositivo implantable según la reivindicación 11, en el que el dispositivo es un tubo vascularizado subcutáneo que comprende la preparación de islotes de cerdo xenotrasplantables, que es capaz de producir insulina

55 de cerdo en respuesta a glucosa en un mamífero receptor, limitando el tubo in vivo la salida de las células de los islotes y permitiendo un acceso abundante a los vasos sanguíneos, empleando o conteniendo también el tubo células de Sertoli para reducir o evitar sustancialmente el rechazo inmunitario de los tejidos en el mamífero receptor.

13. Un dispositivo implantable según la reivindicación 12, en el que las células de los islotes se han aislado de un cultivo ayudado por HSA utilizando una colagenasa adecuada y se han expuesto a nicotinamida antes de la encapsulación en el tubo.

14. Un dispositivo implantable según la reivindicación 12 ó 13, en el que las células de Sertoli se mezclan con los

islotes antes de su inserción en, o dentro de, el tubo. 65

15. Un dispositivo implantable según la reivindicación 12 a 14, en el que las células de Sertoli se mezclan con los

islotes sustancialmente en una relación de 10-1000 células de Sertoli/islote.

16. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho cultivo procede

de tejido pancreático obtenido y reducido mecánicamente, habiendo sido expuesto tal tejido a un agente de 5 reducción de traumatismos.

17. Un dispositivo implantable según la reivindicación 11, en el que el dispositivo es una cápsula xenotrasplantable que comprende la preparación de los islotes de cerdo xenotrasplantables, que es capaz de producir insulina porcina en respuesta a glucosa en un mamífero receptor dentro de su material o materiales de encapsulamiento

biocompatibles, siendo tal la cápsula que la encapsulación es tal como para impedir que el contacto de dicha o dichas células de los islotes con el tejido de un mamífero receptor todavía in vivo permita la entrada de glucosa en las células de los islotes y la salida de insulina porcina desde dichas células de los islotes, en el que las células de los islotes están asociadas a células de Sertoli.

18. Un dispositivo implantable según la reivindicación 17, en el que las células de los islotes se han aislado de un cultivo ayudado por HSA utilizando una colagenasa adecuada y se han expuesto a nicotinamida antes de la encapsulación.

19. Un dispositivo implantable según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicho cultivo procede de tejido pancreático 20 obtenido y reducido mecánicamente, y dicho tejido que se ha expuesto a un agente de reducción de traumatismos.

20. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicha encapsulación ha sido de células de los islotes en presencia de un antibiótico adecuado.

21. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que las células de Sertoli se mezclan con los islotes antes de su encapsulación.

22. Un dispositivo implantable según las reivindicaciones 17 a 21, en el que las células de Sertoli se co-cultivan con

las células de los islotes antes de su encapsulación. 30

23. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que la relación de células de Sertoli:islote es de 10-1000 células:islote.

24. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que el material 35 biocompatible adecuado es un alginato adecuado.

25. Un dispositivo implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24, para uso en el tratamiento de un paciente mamífero predispuesto a la diabetes o que padece de diabetes.

26. Un dispositivo implantable para uso según la reivindicación 25, en el que también se incluye la etapa de administrar nicotinamida al mamífero receptor antes o después de la etapa de implantación.

27. Un dispositivo implantable para uso según la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que el método incluye

adicionalmente la etapa de prescribir al paciente, antes o después de la etapa de implantación, una dieta libre en 45 caseína.

28. Un dispositivo implantable para uso según la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que el método incluye adicionalmente la etapa de someter al paciente, antes o después de la etapa de implantación, a un régimen farmacológico para reducir el colesterol.