Preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina de alta pureza y su uso en ensayos de quimioluminiscencia para la medición de la actividad peroxidasa.

Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina,

caracterizado porque la síntesisconsiste en:

a. La preparación del anión de fenotiazina,

b. La reacción de dicho anión con un éster alquilsulfónico cíclico (sultona)con la precipitación de dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina en forma cristalina,en el que la etapa a. de preparación del anión de fenotiozina tiene lugar in situ en una solución que contienetetrahidrofurano mediante la adición de una base y en la que dicho éster alquilsulfónico cíclico (sultona) estáseleccionado de entre 1,3-profano sultona y 1,4-butano sultona.

Preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina de alta pureza y su uso en ensayos de quimioluminiscencia para la medición de la actividad peroxidasa

Los derivados de fenotiazina, solubles en agua y, especialmente, los N-alquilsulfonatos descritos en la presente invención, son compuestos útiles para diversas aplicaciones comerciales, incluyendo su uso como reactivos para ensayos químicos y biológicos y, en particular, como potenciadores de la actividad de la enzima peroxidasa en ensayos de quimioluminiscencia con luminol, y como aceleradores en sistemas peroxidasa/acelerador en la composición de detergentes y en sistemas para la conversión de la energía solar en energía química o eléctrica.

La clase de compuestos relacionados con la presente invención puede ser representada por la fórmula (I) :

en la que M+ es un catión y n es un número entero. El catión puede ser H+, un catión monovalente (tal como H+, Na+, Li+, K+, NH4+) , otro catión inorgánico, un catión orgánico, etc., o un catión polivalente (incluyendo cationes divalentes) donde la carga restante es neutralizada por otros aniones (por ejemplo, haluros, nitratos, sulfatos, fosfatos) o puede formar múltiples sales con otras moléculas de N-alquilsulfonatos de fenotiazina.

La cadena alquilo - (CR1R2) n-, que conecta el grupo sulfónico al nitrógeno de fenotiazina, puede contener cualquier número º 2 de grupos metileno, aunque n = 3 (propilo) y n = 4 (butilo) son especialmente preferentes. Los grupos metileno CR1R2 en la cadena alquilo pueden ser disustituidos, monosustituidos o no sustituidos.

Esta clase de compuestos es relativamente costosa, especialmente debido a que los procedimientos sintéticos actuales son ineficientes. Además, y de manera más significativa, los productos preparados según los procedimientos

actuales son muy difíciles de obtener en la forma extremadamente pura requerida por los ensayos inmunoenzimáticos basados en la determinación de la actividad peroxidasa por medio de quimioluminiscencia.

Un procedimiento sintético para la síntesis de 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio es descrito por Y. Kawanishi, N. Kitamura y S. Tazuke, J. en " Coulombic Effect of Photoinduced Electron-Transfer Reactions between Phenothiazines and Viologens", J. Phys. Chem. 1986; 90:2469-2475. Este procedimiento requiere dos etapas:

(1) La sal de sodio de fenotiazina se hace reaccionar con un exceso de 1, 3-dibromopropano. El producto, 10- (3bromopropil) fenotiazina se obtiene con un rendimiento del 18% después de una purificación mediante cromatografía en columna (Al2O3/hexano) .

(2) La 10- (3-bromopropil) fenotiazina purificada se hace reaccionar con un ligero exceso de sulfito de sodio en acetonitrilo-agua (4/1 v/v) . El solvente es eliminado y el producto crudo es disuelto en una pequeña cantidad de

metanol y se vuelve a precipitar con benceno seco. El precipitado es recogido sobre un filtro, es secado y purificado mediante cromatografía en gel. El producto purificado, 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio, se obtiene con un rendimiento del 51%.

Según este procedimiento, el producto deseado, 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio, se obtiene con un rendimiento total de sólo el 9%, y con el uso masivo de procedimientos cromatográficos costosos. Un procedimiento 45 similar es descrito también por M. Sakaguchi, M. Hu y L. K, en " Photoionization of Alkylphenothiazines in Vesicles: Effects of the Alkyl Chain Length and the Vesicle Surface Charge", J. Phys. Chem., 1990; 94:870-874; el rendimiento no

se muestra) .

En la patente US No. 5.171.668 "Method of the Chemiluminescence Assays of the Activity of Peroxidase", concecida a Fujirebio, se describe, por primera vez, el uso de derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazinas y, en particular, de 3 (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio, como potenciadores de la quimioluminiscencia de luminol. Esta patente no contiene ninguna descripción específica del procedimiento de preparación de los derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazinas empleados como potenciadores, sino que hace referencia, simplemente, a los procedimientos sintéticos generales de fenotiazinas indicados en Bodea et al, Advances in Heterocyclic Chemistr y , 1968; 9:322-460. Los resultados obtenidos por Fujirebio con derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazina y, en particular, con 3- (fenotiazina10-il) propano-1-sulfonato de sodio, no son significativamente mejores que los observados con un potenciador estándar, tal como 4-yodofenol, a excepción de una "mayor reproducibilidad", definida vagamente.

Por el contrario, la patente US No. 6.432.662, "Assay of Peroxidase Activity", concedida a Pierce, describe un procedimiento para el ensayo de la actividad peroxidasa, el cual, aunque usa los mismos potenciadores que los descritos en la Patente US No. 5.171.668 de Fujirebio y, en particular, 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio, se afirma que ofrece un rendimiento muy superior en términos de cinética e intensidad de la señal quimioluminiscente. Según la patente US No. 6.432.662, dicha diferencia de rendimiento se atribuye a la presencia de impurezas en el potenciador. En particular, la presencia de fenotiazina en el potenciador desactiva la enzima peroxidasa y, por tanto, es extremadamente perjudicial para la producción de la señal quimioluminiscente.

El procedimiento descrito en la patente US No. 6.432.662 para la preparación del potenciador, 3- (fenotiazin-10il) propano-1-sulfonato de sodio, es el procedimiento de Y. Kawanishi, N. Kitamura y S . Tazuke, indicado anteriormente. Además, según la patente US No. 6.432.662, el producto obtenido con este procedimiento contiene "impurezas o trazas de impurezas que no pueden ser eliminadas mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica", sin revelar ningún procedimiento de purificación específico.

Por otra parte, hay que subrayar que la necesidad de usar materiales de alta pureza en sustratos para quimioluminiscencia es ampliamente conocida.

Por ejemplo, el artículo de M.A. Motsenbocker y K. Kondo, " Improvements to Enhanced Horseradish Peroxidase Detection Sensitivity" J. Biolum. Chemilumin., 1994; 9:15-20 (1994) afirma que: "Los resultados son consistentes con un mecanismo de interferencia sencillo mediante el cual los radicales del potenciador producidos por la enzima son neutralizados preferentemente por los contaminantes en el luminol, en el potenciador y en el solvente usado para solubilizar el potenciador. El consumo de estos interferentes retrasa la emisión de luz y reduce el límite de detección de la peroxidasa (HRP) ".

Es evidente que el procedimiento de síntesis de 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio, descrito inicialmente por Y. Kawanishi, N. Kitamura y S. Tazuke, y usado subsiguientemente en la patente US No. 6.432.662, no sólo es ineficiente (rendimiento del 9%) , sino que genera un producto contaminado con impurezas que son muy difíciles de eliminar. La presencia de estas impurezas es incompatible con el uso de 3- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio como potenciador de la quimioluminiscencia en ensayos para la determinación de la peroxidasa.

ELECTROANALYSIS, 18 (18) , 1771-1777, 2006 divulga un procedimiento de preparación de PPSA ácido (3- (10Hfenoxazin-10-il) -1-propanosulfónico) vía un procedimiento de dos etapas que comprende la reacción de fenoxazina con NaH en dioxano, seguido por una reacción con 1, 3-propanosulfona y la precipitación del producto.

JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY, 94 (2) , 870-4, 1990 divulga un procedimiento de preparación (PC3SO3Na) vía un procedimiento de dos etapas que comprende la reacción de fenotiazina con NaH y un 1, 3-dibromopropano, seguido por una reacción con Na2SO3.

Breve descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es un nuevo procedimiento para la síntesis de derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazina de excepcional pureza y en altos rendimientos. El procedimiento consiste en la reacción del anión de fenotiazina con una alquil sultona (sulfona cíclica) en un solvente apropiado.

El procedimiento es simple y directo, basado en la cristalización del producto puro a partir de la mezcla de reacción. Por el contrario, las impurezas permanecen en solución y, a continuación, son eliminadas de una manera muy sencilla y efectiva.

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1. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina, caracterizado porque la síntesis consiste en:

a. La preparación del anión de fenotiazina,

b. La reacción de dicho anión con un éster alquilsulfónico cíclico (sultona)

con la precipitación de dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina en forma cristalina,

en el que la etapa a. de preparación del anión de fenotiozina tiene lugar in situ en una solución que contiene

tetrahidrofurano mediante la adición de una base y en la que dicho éster alquilsulfónico cíclico (sultona) está seleccionado de entre 1, 3-profano sultona y 1, 4-butano sultona.

2. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina presentan la fórmula química (I)

en la que

M+ es un catión monovalente, polivalente, orgánico o inorgánico, preferentemente H+, Na+, Li+, K+, NH4+,

R1 y R2 son H y

n es igual a 3 ó 4.

3. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha base está seleccionada de entre hidruro de sodio, amida de sodio, butil litio, diisopropilamida de litio.

4. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según una cualquiera de las

reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho N-alquilsulfonato es la sal sódica de 4- (fenotiazin-10il) propano-1-sulfonato.

5. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho N-alquilsulfonato es la sal sódica de 4- (fenotiazin-10-il) butano1-sulfonato.

6. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según la reivindicación 4, caracterizado porque el contenido de fenotiazina en dicho 4- (fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio es inferior a 0, 0002 partes (mol/mol) .

7. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según la reivindicación 5,

caracterizado porque el contenido de fenotiazina en dicho 4- (fenotiazin-10-il) butano-1-sulfonato de sodio es 40 inferior a 0, 0002 partes (mol/mol ) .