Planta de canola productora de semillas que contienen una fracción de aceite que comprende menos del 3,

5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico, comprendiendo dicha planta al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5, y siendo dichos saturados totales la suma de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 20:0, 22:0 y 24:0.

Plantas con niveles nulos o reducidos de ácidos grasos saturados en sus semillas y aceite derivado de dichas semillas.

Antecedentes de la invención

Los aceites de origen vegetal han sustituido gradualmente a los aceites y las grasas de origen animal como principal fuente de grasa alimentaria. Pese a ello, en la mayoría de los países industrializados, la ingesta de grasas saturadas sigue suponiendo entre el 15% y 20% del consumo total de calorías. En su esfuerzo por fomentar hábitos más saludables, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) ha recomendado recientemente que las grasas saturadas supongan menos del 10% de la ingesta calórica diaria. Para facilitar la concienciación del consumidor, las actuales instrucciones de etiquetado emitidas por el USDA exigen ahora que el nivel total de ácidos grasos saturados sea inferior a 1, 0 g por ración de 14 g para que un alimento pueda recibir la etiqueta de "Bajo contenido en grasas saturadas” (“low-sat”) e inferior a 0, 5 g por ración de 14 g para recibir la etiqueta de “Sin grasas saturadas” (“no-sat”) . Esto significa que el contenido en ácidos grasos saturados de los aceites vegetales tiene que ser inferior al 7% y al 3, 5% para recibir las respectivas etiquetas de "bajo en" y "sin” grasas saturadas. Desde la emisión de estas directrices, la demanda por parte de los consumidores de aceites con bajo contenido en grasas saturadas ha experimentado un gran aumento. Hasta la fecha, dicha demanda se ha satisfecho fundamentalmente con el aceite de canola y, en mucha menor medida, con los aceites de girasol y de cártamo.

Las características del aceite, ya sea de origen vegetal o animal, dependen principalmente del número de átomos de carbono y de hidrógeno, así como del número y la posición de los enlaces dobles que comprenden las cadenas de ácidos grasos. La mayoría de los aceites vegetales están compuestos por cantidades variables de los ácidos grasos palmítico (16:0) , esteárico (18:0) , oleico (18:1) , linoleico (18:2) y linolénico (18:3) . De ordinario, el ácido palmítico y esteárico se denominan "saturados" porque sus cadenas de carbono están saturadas por átomos de hidrógeno y, por tanto, carecen de enlaces dobles; contienen el máximo número posible de átomos de hidrógeno. En cambio, los ácidos oleico, linoleico y linolénico, están formados por cadenas de ácido graso de 18 carbonos dotadas de uno, dos y tres enlaces dobles, respectivamente. El ácido oleico se considera normalmente un ácido graso monoinsaturado, mientras que el ácido linoleico y linolénico se consideran ácidos grasos polinsaturados. El Ministerio de Agricultura de Estados Unidos define los productos sin grasas saturadas (“no sat”) como todo aquel producto que contiene menos del 3, 5% en peso de ácidos grasos saturados combinados (respecto a la cantidad total de ácidos grasos) .

Las grasas insaturadas (monoinsaturadas y polinsaturadas) resultan beneficiosas, sobre todo cuando se consumen con moderación, pero, en cambio, las grasas saturadas y trans no lo son, puesto que elevan los niveles de colesterol LDL en la sangre. El colesterol ingerido con los alimentos también aumenta el colesterol LDL y puede contribuir a causar cardiopatías aun sin elevar las LDL. Por consiguiente, una alimentación sana requiere el consumo de alimentos con un bajo contenido en grasas saturadas, grasas trans y colesterol.

El valor para la salud de los niveles elevados de monoinsaturados, en particular del ácido oleico, como principal componente graso de la dieta, ha sido confirmado por estudios recientes. Se cree que las dietas de ese tipo reducen la incidencia de arteriosclerosis que provocan las dietas ricas en ácidos grasos saturados. En consecuencia, existe una necesidad de aceites vegetales comestibles con un alto contenido de ácidos grasos monoinsaturados. La mutagénesis de las semillas se ha utilizado para producir un aceite de semilla de colza con un contenido máximo de ácidos grasos saturados del 4% (Solicitud de patente internacional PCT, número de publicación WO 91/15578) .

Más del 13% del suministro mundial de aceite comestible en 1985 se produjo a partir de la planta oleaginosa Brassica, denominada vulgarmente colza. Brassica es la tercera fuente más importante de aceite comestible, sólo superada por la soja y la palmera de aceite. Como la Brassica es capaz de germinar y crecer con temperaturas relativamente bajas, también es uno de los pocos cultivos oleaginosos comestibles comercialmente importantes que pueden cultivarse en las regiones agrícolas más frías, además de servir como cultivo de invierno en zonas más templadas. Asimismo, los aceites vegetales en general, y el aceite de colza en particular, son cada vez más utilizados en aplicaciones industriales debido a su potencial para ofrecer un rendimiento comparable al de los aceites sintéticos o minerales/ nafténicos, con la gran ventaja añadida de que son biodegradables.

El aceite de canola es el aceite vegetal con menor contenido en ácidos grasos saturados. "Canola" alude a la semilla de colza (Brassica) que contiene como máximo un 2 por ciento en peso de ácido erúcico (C22:1) respecto al contenido total de ácidos grasos por semilla (y preferiblemente como máximo un 0, 5 por ciento en peso y, con mayor preferencia, básicamente el 0 por ciento en peso) y que produce, después de la molturación, una harina seca (con aire) que contiene menos de 30 micromoles por gramo de harina desgrasada (sin aceite) . Estos tipos de semilla de colza se distinguen por su comestibilidad en comparación con variedades más tradicionales de la especie.

Los aceites vegetales se pueden modificar mediante métodos químicos. Este tipo de métodos se han utilizado para obtener un aceite para ensalada/cocina con un contenido de ácidos grasos saturados inferior al 3% aproximadamente (nº Pat. US 4 948 811) ; el aceite se puede formar a partir de una reacción química o por la separación física de los lípidos saturados. En dicha patente se hace una referencia general al uso de la "ingeniería genética" para conseguir un aceite de las características deseadas (véase la columna 3, línea 58 y siguientes) , pero en ningún momento se ofrece una explicación detallada de cómo se puede modificar una planta oleaginosa concreta para disponer del aceite vegetal de las características deseadas.

La composición de ácidos grasos de los aceites vegetales se ha venido modificando típicamente por medio de las técnicas de mejora genética tradicionales. Estas técnicas utilizan el germoplasma existente como fuente de mutaciones naturales que alteran la composición de ácidos grasos. Tales mutaciones se descubren y se seleccionan utilizando el cribado adecuado, conjuntamente con la mejora posterior. Así, por ejemplo, se ha utilizado esta estrategia para reducir la cantidad de erucato, un ácido graso de cadena larga, en el aceite de colza (Stefansson, B. R. [1983] en High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils, Kramer J. K. G. et al., eds; Academic Press, New York; pp. 144-161) , así como para aumentar la cantidad de oleato, un ácido graso monoinsaturado, en el aceite de maíz (solicitud de patente US nº Ser. 07/554.526) .

En fecha reciente, se ha recurrido al empleo de mutágenos para aumentar el número de mutaciones a partir de las cuales poder seleccionar las características deseadas. Sin embargo, los mutágenos actúan por lo general inactivando o modificando genes que ya existen, lo cual provoca una pérdida o reducción de una función particular. Así pues, la introducción de una nueva característica mediante mutagénesis, conlleva a menudo la pérdida de algún carácter existente. Además, conseguir los objetivos deseados con mutágenos suele ser una empresa incierta. Tanto es así, que son contados los tipos de composiciones modificadas de ácidos grasos logradas de este modo en aceites vegetales. Un ejemplo de mutación "creada" que afecta a la composición de ácidos grasos es la disminución de los ácidos grasos polinsaturados en el aceite de colza, en concreto del linoleato y el linolenato, acompañada de un aumento del ácido graso monoinsaturado oleato (Auld, M., et al., [1992] Crop Sci. en prensa) . Otro ejemplo consiste en la disminución de los ácidos grasos saturados en ese mismo tipo de aceite (Solicitud de patente internacional PCT, número de publicación WO 91/15578) . Con todo, la bioquímica de la síntesis del aceite de semillas es compleja y no se conoce con precisión: varios mecanismos podrían contribuir a los cambios en las composiciones de los ácidos grasos observados en el aceite de colza... [Seguir leyendo]

1. Planta de canola productora de semillas que contienen una fracción de aceite que comprende menos del 3, 5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico, comprendiendo dicha planta al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5, y siendo dichos saturados totales la suma de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 20:0, 22:0 y 24:0.

2. Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende del 70% al 78% de ácido oleico.

3. Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende como máximo un 3% de ácido linolénico.

4. Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende del 70% al 78% de ácido oleico y como máximo un 3, 5% de ácido linolénico.

5. Semillas producidas por la planta de canola según la reivindicación 1, en las que las semillas comprenden menos del 3, 5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico y comprenden al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5

6. Planta de canola según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite presenta como máximo un 2, 7% de saturados totales.

7. Semillas de canola según la reivindicación 5, que contienen una fracción de aceite que comprende como máximo un 2, 7% de saturados totales.

8. Planta según la reivindicación 1, en la que dicha planta tiene al menos 100 cm de altura y un peso medio de semilla superior a 3 mg.

Reducción >60% de los ácidos grasos saturados. -> En el mejor de los casos más de 16:1 (5, 9%) que de 16:0 (4, 4%)

FIG. 1

Como WT Con expresión de delta-9

FIG. 2

Tres plantas transgénicas derivadas de un callo, todas positivas en el Southern, el patrón de Southern indica un evento.Análisis de FAME en semillas sueltas de la generación T1 (-> T2 en Arabidopsis) .

En el mejor de los casos, reducción del 43% en los saturados (50% cuando se incluye 24:0)

FIG. 3

FIG. 4A

Datos de ácidos grasos

Datos de ácidos grasos

T2 Datos GHT3 datos de semillas enteras de GH

HS

218-11.30 T3 Ácido graso, Datos de grupos de 10 semillas seleccionada.

21. 11.30 T3 Ácido graso, Cantidad de Datos de grupos de 10semillas semillas seleccionadas

218-11.30 T2 Datos sobre ácido graso, Datos de HS

Canola Delta-9 F3 Progenie de los cruces de eventos superiores69_11.19 x 36_11.19 digestión con EcoRI Sonda=Delta-95-02-05 GS FIG. 8 Canola Delta-9 F3 Progenie de los cruces de eventos superiores69_11.19 x 218_11.30 digestión con EcoRI Sonda=Delta-95-2-05 GS FIG. 9