Un péptido de 10 a 23 aminoácidos de longitud, en el que dos de los aminoácidos son aminoácidos no naturalesque tienen estoiquiometría R o S en el carbono α

,en el que el carbono α de los aminoácidos no naturales está unido a un grupo metilo y un grupo olefínico, en el quelos dos grupos olefínicos de los aminoácidos no naturales se encuentran en el mismo lado de la hélice α y se unenpara formar un enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales,

en el que la secuencia de aminoácidos del péptido comprende

(I/V)(T/S)(F/W/Y)(E/S)(D/E)L(L/D/T)(D/A/S)(Y/F)(Y/M);

en el que los dos aminoácidos no naturales sustituyen dos de los aminoácidos en una posición separada 4aminoácidos (i e i+4), en los aminoácidos cuarto [(E/S)] y octavo [(D/A/S)] del péptido, y si están presentes, en losaminoácidos séptimo [(L/D/T)] y undécimo [(E/S)] 7 del péptido o los aminoácidos octavo [(D/A/S)] y duodécimo delpéptido; y

en el que el enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales es un grupo alquenilo.

Péptidos antivirales helicoidales, de pequeño tamaño, terapeúticos y estabilizados

Antecedentes de la invención

(1) Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a tratamientos para la infección por VIH. Más específicamente, la invención proporciona péptidos que inhiben el ensamblado de virus que contienen una cápsida y a procedimientos para el uso de esos péptidos para el tratamiento de virus que contienen una cápsida, incluido el VIH.

(2) Descripción de la técnica relacionada

El ensamblado es una etapa crítica en el ciclo de vida del HIV-1 (Morikawa, 2003; Huseb et al., 2005; Gottliger, 2001; Freed, 1998) y, en general, se cree que ocurre mediante la polimerización controlada de la poliproteína gag, que es transportada a la membrana plasmática, donde se produce el ensamblado y se forman las partículas del virus y brotan como partículas esféricas, inmaduras, no infecciosas. Datos recientes indican que la poliproteína gag puede acumularse y ensamblarse también en partículas virales en los endosomas finales, denominados, frecuentemente, cuerpos multivesiculares (MVB) , especialmente en los macrófagos (Pelchen-Matthews et al., 2003; Grigorov et al., 2006; Kramer et al., 2005; Ny degger et al., 2003; Ono y Freed, 2004; Sherer et al., 2003) . Las partículas de virus son liberadas cuando MVB se fusiona con la membrana plasmática.

Recientemente, se ha demostrado que una proteína celular, AP-3, dirige el tráfico intracelular de gag a los MVB (Dong et al., 2005) . Inmediatamente después de la brotación, las partículas son sometidas a un proceso denominado maduración, el cual es esencial para que el virus se convierta en infeccioso, en el que la poliproteína gag es escindida secuencialmente por la proteasa viral en matriz (MA) , cápsida (CA) , nucleocápsida (NC) y dominios p6, así como dos proteínas espaciadores, SPL y SP2. Este proceso desencadena un cambio drástico en la morfología de las partículas y se forma un núcleo denso en electrones rodeado por una cápsida cónica. La formación de la cápsida madura (CA) desempeña un papel crítico en la infectividad viral. Se ha demostrado que las mutaciones en la CA tienen efectos perjudiciales en el ensamblado viral (Abdurahman et al., 2004; Chien et al., 2006; Chu et al., 2006; Douglas et al., 2004; Forshey et al., 2002; Ganser-Pornillos et al., 2004; Guo et al., 2005; Joshi et al., 2006) . Por lo tanto, la cápsida desempeña un papel importante en el ensamblado viral, que es crítico en el ciclo de vida del VIH-1 y ha sido considerado como un objetivo potencial para el desarrollo de nuevas generaciones de fármacos contra el VIH-1.

El principal obstáculo en el desarrollo de fármacos contra el ensamblado ha sido la falta de un sistema de detección efectivo, aunque algún nuevo procedimiento de ensayo ha sido publicado recientemente (Derdowski et al., 2004) . A pesar de esta dificultad, hay informes que identifican péptidos o compuestos de molécula pequeña que alteran el ensamblado del VIH-1 (Niedrig et al., 1994; Hoglund et al., 2002; Garzón et al., 2004; Tang et al., 2003; Sakalian et al., 2006; Li et al., 2003) . La primera identificación de inhibidores de molécula pequeña (CAP-1 y CAP-2) de la cápsida fue indicada por grupo de Summers (Tang et al., 2003) . Aunque la afinidad (Kd) de CAP-1 por la CA N-terminal (N-CA) era solo de ~800 µM la identificación fue el inicio de una búsqueda de potenciales inhibidores contra este objetivo. Recientemente, se ha informado acerca de otro potente inhibidor de molécula pequeña, PA-457, que tiene como objetivo el procesamiento de gag (Li et al., 2003) . Estos inhibidores de molécula pequeña interfieren con la maduración de VIH-1. El último compuesto se encuentra actualmente en la Fase II de ensayos clínicos.

Recientemente, un pequeño péptido lineal (CAI) ha sido identificado mediante la técnica de visualización de fago, que inhibe el ensamblado in vitro de HIV-1 que tiene como objetivo la CA C-terminal (C-CA) de la cápsida (Sticht et al., 2005) . Aunque un análisis cristalográfico de rayos X reveló que CAI forma una hélice y se une a una ranura hidrófoba formada por las hélices 1, 2 y 4 de C-CA (Temois et al., 2005) , no se ha informado acerca de su conformación en solución. La constante de disociación (Kd) fue estimada en ~15 µM. CAI fue el primer compuesto sobre el que se informó que presentaba inhibición in vitro contra partículas HIV-1, maduras e inmaduras. Sin embargo, el principal inconveniente de CAI es que no puede penetrar en las células, por lo tanto, no puede ser usado como un inhibidor de ensamblado en las células vivas.

Sería deseable disponer de un inhibidor del ensamblado de VIH que pueda penetrar en las células infectadas. La presente invención aborda esa necesidad.

Schafmeister CE, et al, J Am Chem Soc (2000) , 122, 5891-5892 divulga un procedimiento de establecimiento de la conformación hélice-α de un péptido, introduciendo un par de aminoácidos α no naturales con el carbono α sustituido con un grupo metilo y una fracción alifática con un enlace terminal insaturado.

Walensky LD, et al, Science (2004) , 305, 1466-1470 divulga el uso de la estrategia química denominada encadenamiento de hidrocarburos para generar péptidos BH3 con propiedades farmacológicas mejoradas. Los péptidos encadenados demostraron ser helicoidales, resistentes a proteasas y permeable a células.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los péptidos α-helicoidales que son anti-virales in vitro, pero que no pueden penetrar en las células, puede hacerse que penetren en las células y sean activos in vivo si el péptido es estabilizado usando procedimientos de enlace cruzado que incrementan la helicidad α del péptido en solución.

La presente invención está dirigida a un péptido de 10 a 23 aminoácidos de longitud, en el que dos de los aminoácidos son aminoácidos no naturales que tienen estereoquímica R o S en el carbono α,

en el que el carbono α de los aminoácidos no naturales está unido a un grupo metilo y a un grupo olefínico, en el que los dos grupos olefínicos de los aminoácidos no naturales se encuentran en el mismo lado de la hélice α y están unidos para formar un enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales,

en el que la secuencia de los aminoácidos del péptido comprende (I/V) (T/S) (F/W/Y) (E/S) (D/E) L (L/D/T) (D/A/S) (Y/F) (Y/M) [ (SEQ ID no. 3) ];

en el que los dos aminoácidos no naturales sustituyen dos de los aminoácidos en una posición separada 4 aminoácidos (i e i +4) , en los aminoácidos cuarto [ (E/S) ] y octavo [ (D/A/S) ] del péptido, y si están presentes, los aminoácidos séptimo [ (L/D/T) ] y undécimo del péptido o los aminoácidos octavo [ (D/A/S) ] y duodécimo del péptido; y

en el que el enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales es un grupo alquinilo.

La presente invención está dirigida también a los péptidos de la invención para su uso en el tratamiento de una infección en un mamífero, causada por un virus que contiene una cápsida, mediante la inhibición del ensamblado del virus que contiene una cápsida.

La presente invención está dirigida también a una composición farmacéutica que comprende el péptido de la invención, que puede inhibir el ensamblado de un virus que contiene una cápsida, en un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención está dirigida también al uso del péptido de la invención que puede inhibir el ensamblado del virus que contiene una cápsida en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero con un virus que contiene una cápsida o el tratamiento profiláctico de un mamífero para reducir el riesgo de que el mamífero sea infectado con un virus que contiene una cápsida.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa gráficas de los resultados experimentales que muestran la penetración y/o asociación celular del péptido lineal (SEQ ID NO: 1; CA1) y restringido (NYAD-1) . Los gráficos son análisis FACS de células 293T y MT2, incubadas durante 4 horas a 37ºC, con péptidos FITC-conjugados. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS antes del análisis. Panel superior: Izquierda, análisis FACS de células 293T sin péptido FITC. Centro, análisis FACS de células 293T con FITC-CAI. Derecha, análisis... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de 10 a 23 aminoácidos de longitud, en el que dos de los aminoácidos son aminoácidos no naturales que tienen estoiquiometría R o S en el carbono α,

en el que el carbono α de los aminoácidos no naturales está unido a un grupo metilo y un grupo olefínico, en el que 5 los dos grupos olefínicos de los aminoácidos no naturales se encuentran en el mismo lado de la hélice α y se unen para formar un enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales,

en el que la secuencia de aminoácidos del péptido comprende

(I/V) (T/S) (F/W/Y) (E/S) (D/E) L (L/D/T) (D/A/S) (Y/F) (Y/M) ;

en el que los dos aminoácidos no naturales sustituyen dos de los aminoácidos en una posición separada 4

aminoácidos (i e i+4) , en los aminoácidos cuarto [ (E/S) ] y octavo [ (D/A/S) ] del péptido, y si están presentes, en los aminoácidos séptimo [ (L/D/T) ] y undécimo [ (E/S) ] 7 del péptido o los aminoácidos octavo [ (D/A/S) ] y duodécimo del péptido; y

en el que el enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales es un grupo alquenilo.

2. Péptido según la reivindicación 1, que comprende de 11 a 23 aminoácidos, en el que el aminoácido siguiente 15 (Y/M) es (G/S/T/N/H/C/L/R/D/E/Q/M/K) .

3. Péptido según la reivindicación 2, en el que el aminoácido siguiente (Y/M) es G.

4. Péptido según la reivindicación 2, que comprende de 12 a 23 aminoácidos, en el que el aminoácido siguiente (G/S/T/N/H/C/L/R/D/E/Q/M/K) es (P/M/R/K) .

5. Péptido según la reivindicación 4, que comprende de 12 a 23 aminoácidos, en el que el aminoácido siguiente 20 (G/S/T/N/H/C/L/R/D/E/Q/M/K) es P.

6. Péptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido comprende ITFEDLLDYYGP (SEQ ID NO: 1) .

7. Péptido según la reivindicación 1, en el que el enlace cruzado entre los dos aminoácidos no naturales es

en el que las (C) son los carbonos α de los aminoácidos no naturales.

8. Péptido según la reivindicación 2, en el que los aminoácidos no naturales sustituyen los aminoácidos séptimo [ (L/D/T) ] y undécimo