Composición antiviral que comprende un péptido capaz de unirse a la proteína DLC8 seleccionada del grupo:

SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 14 cuando esta última secuencia tiene el resto aminoacídico Ser situado en la primera posición y/o el resto aminoacídico Ala situado en la tercera posición

Nuevos péptidos antivirales del virus de la fiebre porcina Africana que impiden la unión del virus a DLC8

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo técnico del desarrollo de nuevos compuestos antivirales y su uso en la prevención o tratamiento de infecciones por virus en animales o seres humanos.

Antecedentes de la invención

Los virus son parásitos intracelulares que requieren de la integridad de ciertas funciones celulares para que su ciclo replicativo dentro de las células pueda realizarse con éxito. La dineína ha demostrado tener un papel relevante en distintos pasos de la infección de virus en diferentes modelos virales tales como el virus de la rabia, el virus Herpes simple humano tipo I o el virus de la inmunodeficiencia humana. La dineína es una proteína motora microtubular, que interviene en el transporte intracelular ligado a microtúbulos y la ruta endosomal es moduladora de diferentes vías de traducción de señales intracelulares, entre otras funciones. Los virus utilizan la dineína para su internalización y transporte intracelular, para la formación de la factoría vírica donde se van a producir los nuevos viriones y para la regulación de la señalización celular necesaria en la coordinación de estos y otros procesos.

En particular, la proteína p54 del virus de la Peste porcina africana (VPPA) , interacciona con una proteína celular que es parte del complejo motor microtubular llamado dineína y su función está relacionada esencialmente con el transporte intracelular [1]. Está interacción se encontró empleando el sistema de doble híbrido en levaduras (un sistema heterólogo) , buscando proteínas interactoras en una genoteca de ADNc de macrófagos porcinos con respecto a posibles proteínas de interacción de la proteína vírica p54. La secuencia codificante para p54 (gen E183L) está incluida en la secuencia completa del aislado BA71V, depositada en la base de datos del NCBI con número de acceso U18466. Los clones obtenidos e identificados como positivos se secuenciaron para descubrir que contenían la secuencia codificante completa de la cadena ligera de la dineína de 8 kilodaltons (kDa) , llamada DLC8, LC8, DLC1, DNLC1 o PIN (proteína inhibidora de la sintetasa del óxido nítrico neuronal) . La secuencia codificante para DLC8 en Sus scrofa se ha depositado en la base de datos del NCBI con el número AF436777. Posteriormente este resultado se corroboró utilizando otro tipo de técnicas incluyendo cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y colocalización de ambos componentes mediante microscopía confocal. Los resultados obtenidos confirmaron la interacción entre p54 de VPPA y DLC8.

DLC8 es una proteína con una secuencia nucleotídica y aminoacídica altamente conservada entre especies evolutivamente distantes (desde nematodos al hombre) [2, 3]. Las dineínas citoplásmicas son una familia de motores moleculares que conducen cargas diferentes a lo largo de los microtúbulos. Se encargan del transporte de vesículas, endosomas y orgánulos desde el exterior de la célula al interior, a la zona nuclear o perinuclear. Son grandes complejos multiproteicos, constituidos por de una a tres cadenas pesadas con una cabeza globular y actividad ATPasa, que son responsables de generar la energía necesaria para producir movimiento. Unidas a estas cadenas pesadas hay un número variable de cadenas intermedias y de cadenas ligeras. Estas últimas son responsables de interaccionar directamente con la carga a transportar. Se han descrito, hasta la fecha, siete familias de cadenas ligeras, entre las que podemos encontrar a DLC8. DLC8 se encuentra dispuesta como un dímero in vivo, lo que permite la existencia de dos lugares idénticos de unión a diferentes secuencias entre ambos monómeros.

Con respecto a la proteína celular, se han descubierto para DLC8 [12, 13] dos tipos de lugares preferenciales de unión con las proteínas celulares con las que interaccionan. Uno de los motivos (Lys/Arg) XThrThr (siendo X un amino ácido cualquiera) se une a DLC8 con una serie de moléculas tales como la cadena intermedia de la dineína, la molécula proapoptótica Bim, los factores de transcripción Kid1 y Swallow y algunas proteínas virales de diverso origen. Este sitio de unión está localizado entre los dos dímeros de la molécula de DLC8. El segundo motivo es: Gly (Ile/val) GlnValAsp que une a DLC8 con la óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS) o con la proteína de armazón neuronal, como se ha descrito hasta la fecha.

Para identificar los restos aminoacídicos requeridos para la unión de la proteína viral a dineína, se expresaron varios fragmentos truncados de la proteína p54 y se ensayaron en el sistema de levadura para determinar que la zona de unión a DLC8 se localiza en el extremo carboxi terminal de la proteína p54 en 13 aminoácidos comprendidos entre Tyr149 y Thr161 (TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr) [1].

Varios virus utilizan la cadena ligera de la dineína (DLC8) en distintas etapas de su ciclo infeccioso en el interior de la célula hospedadora. Por una técnica llamada pep-scan, se sintetizaron péptidos que se asemejaban a las secuencias lineales de diferentes proteínas de origen viral, se transfirieron al papel de filtro y se exploró con DLC8 para determinar que secuencias lineales eran adecuadas para esa interacción [10]. Las secuencias lineales que aparecen a continuación serían teóricamente adecuadas para unión a DLC8. Estas contienen frecuentemente restos de Gln (Q) , con frecuencia con un resto de T (Thr) contiguo en la secuencia:

- El motivo TyrAlaSerGlnThr de la proteína p54 del virus de la Peste porcina africana

- El motivo TyrSerThrGlnThr de la glicoproteína de unión del virus respiratorio sincitial

- El motivo LysSerThrGlnThr de la proteína P del virus de la rabia y del virus Mokola, de la helicasa del virus del herpes simple humano, de la proteasa de adenovirus, o del entomopoxvirus A. moorei.

- El motivo LysGlnThrGlnThr de la proteína E4 del virus del papiloma humano o de la polimerasa del virus vaccinia.

- El motivo LysGlnThrGlnThr del gen U19 del virus del herpes humano

- El motivo ArValMetGlnLeu de la proteína de la cápsida del virus coxackie humano, etc.

Incluso aunque se ha descubierto que algunas secuencias proteicas virales lineales son teóricamente capaces de unirse a DLC8, esto no excluye que todas estas secuencias deberían ser adecuadas para la interacción de la forma de proteína nativa o cuando la moléculas se integra en el complejo motor in vivo. Además no se demuestra que esas secuencias virales se expongan de algún modo en la partícula viral ni que sus sitios de unión potenciales sean capaces de unirse a DLC8 de hecho y/o si estas proteínas virales se sintetizan en compartimentos celulares accesibles para dineína durante la infección tales como el citosol (no retículo endoplásmico u otros orgánulos y estructuras separada) . Además, no se ha demostrado hasta la fechas que ninguna de estas secuencias lineales sean capaces de bloquear la unión de una proteína dada a DLC8 por ningún medio y, finalmente, nada garantiza que el bloqueo de este sitio de cómo resultado inhibición de la infección. De hecho, hay dos sitios de unión potenciales por molécula de DLC8 como se ha descrito anteriormente y hay varias otras cadenas ligeras e intermedias que podrían usarse como alternativa por cualquier virus. En resumen, ninguno de estos hallazgos demuestra que el bloqueo de este sitio interrumpiría la interacción ni obstaculizaría la infección por virus y nada garantiza que las secuencias anteriormente mencionadas pudieran ser útiles como compuestos antivirales.

Además, para que cualquier péptido sea candidato a usarse como agente antiviral, debería alcanzar por algún medio el ambiente intracelular de forma adecuada y también debe asegurarse toxicidad nula o muy baja en las células vivas. El hecho de que las secuencias de aminoácidos puedan identificarse como implicadas en la unión entre proteínas virales y DLC8, cuando esas secuencias permanecen en estructura primaria (lineal) no excluye que esas secuencias lineales inhiban la interacción de proteína viral y DLC8 y, en consecuencia, los péptidos que comprenden esas secuencias de aminoácidos pueden actuar como compuestos antivirales. Ambas superficies de interacción deberían analizarse (por ejemplo por sus espectros de resonancia magnética nuclear) para diseñar una secuencia peptídica adecuada para bloquear la interacción proteína-proteína. La razón para eso está en el hecho de que las secuencias de aminoácidos lineales, cuando se pliegan en estructura de mayor complejidad en la célula,... [Seguir leyendo]

1. Composición antiviral que comprende un péptido capaz de unirse a la proteína DLC8 seleccionada del grupo: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 14 cuando esta última secuencia tiene el resto aminoacídico Ser situado en la primera posición y/o el resto aminoacídico Ala situado en la tercera posición.

2. Composición antiviral de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que el péptido contiene además medios para aumentar la internalización del péptido en la célula.

3. Composición antiviral de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el medio para internalizar el péptido en la célula consiste en una cola de 8 argininas.

4. Composición antiviral de acuerdo con la reivindicación 1, que también comprende otro compuesto activo y/o cualquier vehículo, excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

5. Composición antiviral de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de las infecciones atribuibles a un virus seleccionado entre: VPPA, virus del papiloma humano, adenovirus, entomopoxvirus A. moorei, virus vaccinia, virus respiratorio sincitial, virus coxackie humano, virus de la rabia, virus del Herpes simple humano, virus Mokola o el virus del SIDA.

6. Péptidos que pertenecen a la familia representada por SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 1 o cualquier secuencia derivada de las mismas con cambios conservativos en al menos un aminoácido y capaces de unirse a la proteína DLC8, que se conjugan para ser detectables con un marcador fluorescente o cualquier etiqueta que permita que se detecten con un anticuerpo secundario, marcadores fluorescentes y cromógenos.

7. Péptidos de acuerdo con la reivindicación 6, seleccionados de: SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 9.

8. Un método in vitro para evaluación de la internalización y tráfico citoplásmico de péptidos, particularmente de origen de virus, en la célula, por cualquier método usado en la actualidad tal como marcar uno de los péptidos que pertenecen a las familias representadas por SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 1 con un marcador rastreable directamente y detectarlo midiendo específicamente la señal emitida por el marcador unido al péptido o, indirectamente, por un marcador de segunda etapa en un anticuerpo secundario.

9. Un método in vitro para estudiar la biología celular y funciones de dineína en la célula marcando uno de los péptidos que pertenecen a las familias representadas por SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 1 o un anticuerpo secundario específico para dicho péptido, con un marcador rastreable y detectándolo midiendo la señal emitida por el marcador unido al péptido o al anticuerpo.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 en el que el péptido o el anticuerpo se marca con un marcador fluorescente tal como fluoresceína, rodamina o cualquier otro marcador fluorescente conocido en el estado de la técnica que permite la detección por microscopio de fluorescencia directa.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 en el que el péptido o el anticuerpo se marca con cualquier marcador no fluorescente tal como biotina, hemaglutinina, c-myc o GST.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en el que el péptido se selecciona de: SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 9.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

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