Moléculas recombinantes de lubricina y usos de las mismas.

Una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23.

Moléculas recombinantes de lubricina y usos de las mismas

La invención se refiere a nuevas moléculas recombinantes de lubricina y a sus usos como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o complementos intraarticulares para, por ejemplo, articulaciones sinoviales, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura.

Antecedentes de la invención

El funcionamiento óptimo de las articulaciones sinoviales depende de unos coeficientes de fricción extremadamente bajos entre los tejidos articulares. Normalmente, se mantiene una superficie contigua y bien lubricada sobre el cartílago articular. Sin embargo, en la artrosis, una reducida lubricación contribuye a la degradación y la fibrilación de la matriz del cartílago; éstas a su vez contribuyen a la disfunción y el dolor articular. Una lubricación reducida también conduce a una disfunción y a un dolor articular y a otras formas de artritis, incluyendo la artritis reumatoide.

Para otros tejidos (por ejemplo, tendones) , una superficie lubricada también contribuye a un funcionamiento óptimo. Además de requerir una superficie lubricada, la función normal del tendón requiere la prevención de la adhesión celular a las superficies del tendón. En la lesión y la reparación de un tendón flexor, por ejemplo, la formación de adhesiones en el tendón es la complicación más habitual.

La proteína lubricina natural está relacionada con la proteína precursora del factor estimulante de los megacariocitos (megakar y ocyte stimulating factor, MSF) . PRG4 (proteoglucano 4) es el nombre del MSF que ha sido aceptado para la base de datos de Nomenclatura de Genes Humanos UCL/HGNC/HUGO. La proteína PRG4 (es decir, la proteína precursora del MSF) se describe en los documentos US6433142 y US20020137894. El polipéptido codificado por el exón 6 del gen PRG4 está muy glucosilado y parece ser necesario para que la proteína relacionada con el PRG4 sirva como lubricante, por ejemplo, entre las superficies del cartílago articular.

Algunos estudios indican que la glucoproteína PRG4 también es sintetizada por los sinoviocitos íntimos que recubren las vainas de los tendones; es muy probable que la glucoproteína también se origine en los tenocitos (Rees y col., 2002) . La glucoproteína está presente de forma prominente en las regiones fibrocartilaginosas del tendón. De una forma complementaria a su función de líquido sinovial, la glucoproteína puede jugar un importante papel citoprotector en los tendones evitando la adhesión celular a las superficies de los tendones, así como proporcionando lubricación durante la función normal del tendón.

El exón 6 del gen PRG4 (también denominado "lubricina") codifica para aproximadamente 76-78 repeticiones de secuencias de tipo KEPAPTT y 6 repeticiones de secuencias de tipo TTTX. La variación en el número de secuencias repetidas comparables en proteínas recombinantes de lubricina según la presente invención permite el desarrollo de bioterapéuticos mejorados para aumentar la lubricación en articulaciones y para contrarrestar una adhesión indeseada entre tejidos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a nuevas moléculas recombinantes de lubricina y a su uso como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o complementos intraarticulares.

Con objeto de optimizar los parámetros de expresión y de investigar la necesidad funcional de aproximadamente todas las 76-78 secuencias de tipo KEPAPTT, se diseñaron constructos de expresión de lubricina que permitían la síntesis de proteínas recombinantes de lubricina con diversos grados de sustitución de oligosacáridos unidos por O. Esto se consigue incorporando cifras variables de las secuencias de tipo KEPAPTT en el "núcleo" de un constructo de ADNc formado por los exones 1 hasta 5, las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del exón 6, y los exones 7 hasta 12. La inserción repetitiva de "casetes de ADNc sintético" que codifican para 40 secuencias múltiples de tipo KEPAPTT facilita la generación de constructos recombinantes de lubricina de diferentes tamaños. El foco inicial de estos estudios fue sobre el constructo PRG4-Lub:1 (que contiene el ADN del " casete sintético 1 de ADNc" (ID. SEC. Nº: 1) , que codifica para cuatro secuencias KEPAPTT) .

Las proteínas recombinantes de lubricina de la presente invención comparten una estructura primaria con varias isoformas de la lubricina humana natural (véanse los documentos WO 010 7068, US6743774, US20040072741 y WO0064930) . De entre las 45 isoformas caracterizadas, cada isoforma difiere en la composición de los exones del gen que codifica para la estructura primaria de la isoforma. Por ejemplo, los exones 1 hasta 12 del gen PRG4 codifica para la isoforma V0, que representa la isoforma completa, mientras que los exones 1 hasta 4 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V1, que carece únicamente de un segmento codificado por el exón 5. Los exones 1 hasta 3 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V2, que carece de los segmentos codificados por los exones 4 y 5. Finalmente, los exones 1, 3 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V3, que carece de los segmentos codificados por los exones 2, 4 y 5. Probablemente existan otras isoformas, y se han descrito algunas proteínas mutantes relacionadas (véase el documento US20020086824) .

En particular, la presente invención proporciona una proteína recombinante de lubricina que comprende secuencias repetitivas de tipo KEPAPTT. En las formas de realización preferidas, la invención proporciona una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23. En formas de realización relacionadas adicionales, la invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la proteína

recombinante de lubricina. En formas de realización preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína. En formas de realización relacionadas adicionales, la invención proporciona un polinucleótido aislado con una identidad de al menos el 80%, el 85%, el 90% el 95%, el 97%, el 98% o el 99% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 sobre la longitud completa de la secuencia.

Tabla 1. Identificación de Secuencias con Identificadores de Secuencia

1. Una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23.

2. Una proteína aislada que comprende la ID. SEC. Nº:7.

3. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína de la reivindicación 1 ó 2

4. El polinucleótido de la reivindicación 3 en el que el polinucleótido comprende las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22.

5. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína recombinante de lubricina y con una identidad de al menos el 95% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 a lo largo de la longitud completa de la secuencia.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5 que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína recombinante de lubricina y con una identidad de al menos el 99% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 a lo largo de la longitud completa de la secuencia.

7. Una proteína recombinante de lubricina codificada por el polinucleótido de la reivindicación 5 ó 6.

8. La proteína de las reivindicaciones 1, 2 ó 7 en la que la proteína está unida por O con - (1-3) -Gal-GalNac.

9. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 en un portador farmacéuticamente aceptable.

10. La composición de la reivindicación 9 que comprende adicionalmente hialuronano o hilano.

11. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para su uso en el tratamiento de un sujeto.

12. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para su uso en el tratamiento de un sujeto mediante su administración a un tejido del sujeto.

13. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el tejido se elige del grupo que consiste en cartílago, membrana sinovial, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura.

14. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el tejido es cartílago.

15. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que dicho uso comprende adicionalmente proporcionar un anestésico al sujeto; proporcionar un fármaco antiinflamatorio al sujeto; proporcionar un antibiótico al sujeto; aspirar fluido del sujeto; lavar tejido del sujeto; y obtener imágenes del tejido del sujeto.

16. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el sujeto se elige del grupo que consiste en un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo y un ser humano.

17. Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el sujeto es un ser humano.

18. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

19. Un procedimiento para producir una proteína recombinante según la reivindicación 1, 2 ó 7 que comprende:

hacer crecer células transformadas con el vector de expresión de la reivindicación 18 en medio de cultivo líquido; y recoger la proteína recombinante del medio.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la recolección de la proteína comprende:

concentrar la proteína filtrando el medio a través de una membrana; recoger la proteína retenida en la membrana; y solubilizar la proteína recogida en una disolución salina tamponada que contiene clorhidrato de L-arginina con una concentración que varía entre 0, 1 y 2, 0 M.

21. El procedimiento de la reivindicación 20 en el que la concentración de clorhidrato de L-arginina es 0, 5 M.