Microplaca para ensayos biológicos, que comprende una serie de pocillos constituidos por un receptáculo (2) abierto por su cara superior,

con fondo plano o cerrado en toda su superficie y dotado en la parte inferior de su pared de un orificio (3) adyacente al fondo plano.

de ser laborioso, tiene otros inconvenientes como son Microplaca para ensayos biológicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una microplaca para ensayos biológicos, especialmente para ensayos celulares o inmunoensayos (tipo ELISA) .

Más concretamente, la microplaca de la invención es del tipo que comprenden una pluralidad de pequeños receptáculos, denominados pocillos, que van abiertos por su cara superior y disponen de un orificio de salida en la parte inferior que desemboca en una cámara de vacío. Antecedentes de la invención Hay un gran número de operaciones de laboratorio que requieren el manejo de múltiples muestras de pequeño volumen. Por ejemplo, tanto técnicas inmunológicas como ensayos basados en células, requieren la continua adición y eliminación de líquidos. Con el fin de manejar esta complejidad muestral, se usan unos tipos de recipientes conocidos comúnmente como placas de pocillos o microplacas, donde tienen lugar reacciones biológicas y químicas con los agentes inmovilizados al sustrato de la placa. Dichas placas están fabricadas típicamente en plástico (como polipropileno, poliestireno o similar) y tienen una serie de pocillos de base plana dispuestos en un patrón geométrico que simplifica la organización y realización de operaciones. Una placa de uso general extendido es la que contiene 96 pocillos en un patrón rectangular de 8 x 12 pocillos. Hay otras microplacas disponibles con diferentes números de pocillos y de capacidades volumétricas inferiores, como por ejemplo placas de 384, 1536 o incluso 3456 pocillos, donde el acceso para el manejo y evacuación de líquidos de los pocillos se hace cada vez más angosto y dificultoso.

En todas las técnicas experimentales y de screening llevadas a cabo en microplacas, se emplean varios pasos en donde los reactivos, nutrientes o soluciones de lavado se añaden a cada pocillo y luego son retirados. Con el fin de obtener una mayor fiabilidad y exactitud de los resultados, a menudo es necesario vaciar los pocillos entre estos pasos y aclararlos con una solución de lavado varias veces para eliminar los restos inespecíficos de reactivo. En el curso de un ensayo de screening, se puede llegar a trabajar con un elevado número de microplacas, haciéndose necesaria la evacuación de cada uno de los pocillos en un número elevado de veces. En los ensayos inmunológicos por ejemplo, el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. Comúnmente, se forma una reacción de color en aquellos pocillos donde el antígeno estaba presente. Los reactivos de todos los pocillos deben lavarse con el fin de prevenir la formación de color en los pocillos donde el antígeno estaba ausente. Otro ejemplo donde hay que evacuar el líquido de los pocillos de una microplaca es en ensayos basados en cultivos celulares. Las células usadas en procesos experimentales son sembradas en microplacas y necesitan de varios lavados entre diferentes reacciones y tratamientos.

Todas estas operaciones de lavado pueden realizarse manualmente o de forma automatizada. En las operaciones manuales, el lavado se lleva a cabo mediante la aspiración individual del líquido de cada pocillo con una pipeta Pasteur conectada a un sistema de vacío o en el mejor de los casos, toda una columna o el riesgo de contacto de la pipeta de aspiración con las muestras, la probabilidad de contaminación líquida entre pocillos adyacentes o la falta de homogeneidad en el rendimiento de ensayo a ensayo. Por lo tanto, este proceso se ha automatizado y actualmente hay varios equipos comerciales disponibles que agregan automáticamente los reactivos, evacuan el líquido de los pocillos, y diluyen las muestras en serie. Todos estos equipos operan de manera similar. Por lo general, las microplacas se encuentran en posición horizontal y una serie de colectores en forma de aguja añaden por la parte superior de la placa una solución de lavado a cada pocillo, seguido de una retirada rápida del líquido de lavado por otro set de agujas de aspiración, empleando un dispositivo de succión de vacío. Las pipetas de aspiración deben de eliminar la mayor cantidad de líquido posible para que el lavado sea eficaz y minimice la cantidad residual de reactivos presente en la base de los pocillos. Este paso requiere una tecnología precisa y sofisticada que consiste a menudo en tecnologías de sensor de líquidos. Las tecnologías que usan sensores de líquidos imponen una sofisticación y un coste extra al equipo. Otro hecho que contribuye de nuevo al aumento del precio de las operaciones de lavado es que en ocasiones se deben utilizar nuevos sets de pipetas para cada lavado con el fin de evitar la contaminación entre sucesivos lavados, dado que las agujas de lavado tocan físicamente el líquido contenido en los pocillos.

Otra de las limitaciones impuestas por la tecnología actual es la dificultad de realizar lavados por rebosamiento en pocillos que poseen un muy reducido diámetro, debido a limitaciones espaciales donde deben coexistir tanto las agujas de dispensación como las de succión. La técnica de lavado por rebose consiste en añadir y eliminar el líquido de los pocillos de forma simultánea para así conseguir un lavado más vigoroso de los pocillos. La eliminación de los líquidos residuales es de vital importancia especialmente cuando se trabaja con cantidades muy pequeñas de líquidos. Los robots están programados para bajar a una ubicación exacta fija en el espacio, pero muy sutiles variaciones en las alineaciones entre pocillos o las variaciones en la profundidad de éstos entre distintos fabricantes, pueden dar lugar a lavados inconsistentes. Por último, las agujas muy delgadas pueden aumentar el riesgo de obstrucción durante la evacuación del líquido. Diversos sistemas en el mercado tratan de evitar este problema mediante el uso de ultrasonidos, cosa que de nuevo encarece la tecnología actual.

A la vista de estos antecedentes, un método de lavado que prescinda del uso de agujas contribuiría a una disminución en el mantenimiento del equipo, evitaría contaminaciones residuales entre lavados, evitaría el problema de obstrucción de las agujas de aspiración, aumentaría la velocidad de procesado y en su conjunto permitiría abaratar las operaciones de lavado de las microplacas convencionales. Por lo tanto, se necesitaría un método de evacuación sin agujas sencillo, rápido y de bajo coste que supere todos los inconvenientes antes mencionados.

En el estado del arte, la evacuación de los pocillos por su base inferior mediante el uso de vacío viene ya descrita en numerosos sistemas de evacuación de líquidos. Por una parte, patentes como PCT/US02/00594, GB2422795 A, EP1366818 A1, EP1262759 A1, US2002098125 A1, US6133045 A, WO9811989 A1, US4927604 A, EP0359249 A o E04021018 nos enseñan el uso de una fuente de vacío con el fin de extraer una fase sólida por medio de filtros que pueden retener bacterias o moléculas tales como ácidos nucleicos o proteínas. Otra patente como WO2004113874 A2, nos enseña la evacuación de líquidos por la parte inferior de los pocillos de base redondeada o cóncava mientras los analitos quedan retenidos mediante una fuerza magnética a las paredes del pocillo. Finalmente, patentes como WO9102073 A o US4090850 A emplean sistemas de succión por vacío en conjunto con membranas permeables que retienen los analitos presentes en inmunoensayos. En concreto, la patente US4090850 A muestra un método de lavado para radioinmunoensayos por el cual la base plana de los pocillos posee un orificio central por donde se evacua el líquido por succión mientras los radio-ligandos sometidos a estudio se encuentran atrapados en un disco de papel de celulosa.

Para facilitar la salida de líquidos mediante una diferencia de presión provocada por el vacío, todas las patentes descritas anteriormente poseen algún tipo de abertura en la misma base de los pocillos. Ninguna de las patentes citadas por lo tanto puede reivindicar su uso para sustratos fijados a la base de los pocillos, como es el caso de inmunoensayos y de ensayos celulares. Esto es debido a que en todas las patentes descritas, el área destinada al sustrato biológico y la abertura destinada a la evacuación de líquidos coexisten en el mismo plano, viéndose de esta manera comprometido el reducido espacio destinado al sustrato biológico de los pocillos de una microplaca. Es por ello que ninguna de estas patentes puede dar respuesta al problema de lavado de microplacas de pocillos planos donde se encuentran adheridos sustratos biológicos tales como antígenos o células. Descripción de la invención

La presente invención tiene por objeto una...

1. Microplaca para ensayos biológicos, que comprende una serie de pocillos abiertos por su cara superior y dotados cada uno de ellos de al menos un orificio de salida de líquidos que desemboca en una cámara de vacío, caracterizada porque cada pocillo está constituido por un receptáculo de fondo plano, cerrado en toda su superficie, y dispone en la parte inferior de su pared de un orificio situado en posición adyacente al fondo plano.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201130318

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 09.03.2011

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201130318

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD B01L3/00 (2006.01)

B01J19/00 (2006.01) G01N33/53 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

B01L, B01J, G01N

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, MEDLINE, BIOSIS, EMBASE, NPL, XPESP, XPOAC, COMPENDX, INSPEC

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201130318

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 27.04.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201130318

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

D01 divulga placas con pocillos de fondo cóncavo, que incluyen orificios para el drenaje de reactivos. En D02 se describe una placa de ELISA con orificios en el fondo de los pocillos. D03 anticipa placas con pocillos, cuya base es plana y presentan un orificio en el fondo. Además, en otro modo de realizar la invención, muestran un pocillo con un filtro que puede encontrarse en diferentes posiciones.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración El objeto de la presente solicitud, es una microplaca de ensayos biológicos, que comprende una serie de pocillos abiertos por su cara superior y con un orificio de salida que desemboca en una cámara de vacío, caracterizada por que cada pocillo está constituido por un receptáculo de fondo plano cerrado en toda su superficie, y un orificio en la parte inferior de su pared en posición adyacente al fondo plano (reivindicación 1) .

1. NOVEDAD (Art. 6.1 LP 11/1986) . La reivindicación 1 cumple el requisito de novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) .

2. ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 8.1 LP 11/1986) .

D01 divulga una microplaca con pocillos de fondo cóncavo que incluyen un orificio. Este orificio se puede encontrar en un lateral del pocillo. Además, el líquido puede ser drenado por los orificios mediante vacío. La principal diferencia entre D01 y la presente solicitud, es que en la solicitud el fondo del pocillo es plano, mientras que en D01 es cóncavo. El efecto técnico es la posibilidad de poder anclar sustratos en el fondo del pocillo. Por lo tanto, el problema a resolver, es el desarrollo de un pocillo en el que se puedan adherir sustratos. D02 anticipa una placa de ELISA en la que los pocillos presentan una apertura en el fondo para poder drenar los reactivos al aplicar vacío.

Se considera que un experto en la materia, intentaría el diseño de microplacas con orificios laterales (D01) conectados a una cámara de vacío y de fondo plano (D02) , con una expectativa razonable de éxito. En consecuencia, la reivindicación 1 no tiene actividad inventiva (Art. 8.1 LP 11/1986) .

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