Método de preparación de una planta resistente al estrés por sequía,

que comprende:

(a) Transformar una población de plantas con una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia que es idéntico, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº:1, ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa; y

(b) seleccionar una planta que es resistente al estrés por sequía

Métodos para generar plantas resistentes a la sequía

Antecedentes de la invención

Los estudios fisiológicos y genéticos indican que la senescencia es un proceso muy regulado (Nooden, Sensecence and Aging in Plants, (L.D. Nooden y A.C. Leopold, Ed.) ) , págs. 391-439, Academic Press, San Diego, Calif., 1988; Thomas, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 31:83-111, 1980) . Los estudios moleculares sugieren que los cambios en la expresión génica están asociados con el programa de senescencia. Por ejemplo, la concentración de proteínas que codifican ARNm implicadas en la fotosíntesis se reduce durante la senescencia (Bate, et al., J. Exp. Bot. 42:801-811, 1991; Hensel, et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Jiang, et al., Plant Physiol. 101:105-112, 1993) , mientras que la concentración del ARNm de los genes que codifican proteínas que se cree que están implicadas en el programa de senescencia, aumentan (Graham, et al., Plant Cell 4:349-357, 1992, Hensel, et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Kamachi, et al., Plant Physiol. 93:1323-1329, 1992; Taylor, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5118-5122, 1993) .

Se ha sugerido que se pueden usar promotores específicos de senescencia para dirigir la expresión de genes seleccionados durante la senescencia. Por ejemplo, la patente de EE.UU 5.689.042, utiliza una construcción génica que comprende un promotor específico de senescencia, SAG12, ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica isopentil-transferasa de Agrobacterium (IPT) , no conectada nativamente a la secuencia del promotor. Las plantas transgénicas que comprenden esta construcción mantienen las hojas verdes más tiempo, dirigiendo la expresión de IPT mediante el promotor SAG12. Se sabe que IPT incrementa la concentración de citoquinina, una clase de hormona vegetal cuya concentración se reduce durante la senescencia y, por tanto, puede jugar un papel para controlar la senescencia de las hojas.

De forma similar, Gan y Amasino muestran que la inhibición de la senescencia de las hojas se puede lograr mediante la producción autorregulada de citoquinina (Gao, et al, Science 270:1986-1988, 1995) . Se han identificado otros promotores inducibles por senescencia. Por ejemplo, se describe el promotor SARK de Phaseolus vulgaris en WO 99/29159 y en Hajouj et al. Plant Physiol.124:1305-1314 (2000) .

Un aspecto útil y deseable de regular internamente la expresión del gen de interés está en la capacidad de regular la expresión sólo en aquellas células que experimentan la senescencia, dejando por tanto a las células normales invariables y libres de los posibles efectos negativos de la sobreproducción de citoquinina.

Aunque se ha demostrado que el uso de la expresión de ITP controlada por SAG12 controla la senescencia de las hojas, otros fenotipos de tales plantas no se comprenden bien. La presente invención se dirige a éstas y otras necesidades.

Resumen breve de la invención

La presente invención se refiere al desarrollo de plantas resistentes a la sequía. Los métodos de la invención proporcionan plantas con resistencia a la sequía incrementada y otras características ventajosas, como el rendimiento incrementado. Además, las plantas de la invención también presentan una mayor eficiencia de uso del agua. Esta invención se refiere a la preparación de plantas transgénicas que expresan una isopentenil-transferasa bajo el control de un promotor inducible por senescencia.

Los métodos de la invención comprenden (a) transformar una población de plantas con una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia, que es idéntico, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº :1, ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopenteniltransferasa; y (b) seleccionar una planta que es resistente al estrés por sequía, en la que la resistencia al estrés por sequía se confiere a la planta mediante la presencia de una casete de expresión recombinante. La etapa de transformación con la casete de expresión se puede realizar usando cualquier método conocido. Por ejemplo, la población de plantas se puede transformar con la casete de expresión usando Agrobacterium. La invención proporciona así mismo el uso de una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia, que es idéntico, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº :1, ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa, para preparar una planta resistente al estrés por sequía.

El promotor SARK se prepara convenientemente a partir de Phaseolus vulgaris y tiene una secuencia idéntica, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº :1. En algunas realizaciones, la isopentenil-transferasa (IPT) es de Agrobacterium. Una secuencia modelo (IPT) es una que sea idéntica al menos en un 95% a la SEQ ID Nº :3.

Los métodos se pueden realizar en cualquier planta susceptible de transformación con construcciones de expresión recombinante. Se ejemplifica aquí la expresión en tabaco. Otras plantas usadas convenientemente en la invención incluyen hierbas de césped.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que las plantas de tabaco WT presentaban un marchitamiento progresivo de las hojas, mientras que dos líneas transgénicas independientes no mostraban síntomas de marchitamiento durante un estrés por sequía de 5 y 7 días sin agua.

Las Figuras 2A-2L muestran plantas de tabaco de 4 meses de edad sometidas a estrés por sequía seguido por rehidratación. Tanto las plantas de tipo silvestre (Fig. 2A) como las de tipo transgénico (Figs. 2B y 2C) presentaban síntomas de marchitamiento de las hojas tras 7 días de sequía. Los síntomas de marchitamiento de las hojas se hacían más pronunciados tras 18 días de sequía, tanto en las WT (Fig. 2D) , como en las dos líneas transgénicas (Figs. 2B y 2F) . La rehidratación de las plantas durante 7 días producía escasos efectos sobre las plantas WT marchitas (Fig. 2G) , pero inducía la recuperación parcial de las líneas transgénicas (Figs. 2H y 2I) , mostrando la línea transgénica T4-24 (Fig. 2I) una recuperación mejor que la línea transgénica T2-36 (Fig. 2H) . La rehidratación de las plantas durante 14 días no recuperó las plantas WT (Fig. 2J) , pero recuperó totalmente ambas líneas transgénicas (Figs. 2K y 2L) .

La Figura 3 muestra el peso fresco de las plantas mostradas en la Fig. 2 tras 14 días de volver a regar. Los valores son Media ± desviación estándar (n = 40) .

La Figura 4 muestra plantas de Arabidopsis WT y plantas transgénicas T1 (pSARK, TPT) tras estrés por sequía y 5 días de rehidratación.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Según se usan aquí, los términos “resistencia a la sequía” o “tolerancia a la sequía” se refieren a la capacidad de una planta para recuperarse de períodos de estrés por sequía (es decir, poca o ninguna agua durante un período de días) . Típicamente, el estrés por sequía será al menos de 5 días, y puede ser de hasta 18 a 20 días.

El término “eficiencia de uso de agua” se refiere a la capacidad de una planta para crecer sin sufrir las consecuencias en su rendimiento, bajo períodos prolongados con cantidades de agua inferiores a las normales (típicamente aproximadamente la mitad) .

El término “senescencia” (también denominado muerte celular programada) , se refiere a un proceso activo, controlado genéticamente, mediante el que las células y tejidos vegetales pierden su organización y función.

El término “gen asociado a senescencia”, se refiere a un gen implicado en la senescencia. La expresión de tal gen se puede inducir (o alterar) durante el proceso de la senescencia.

Según se usa aquí, el término “promotor” incluye todas las secuencias capaces de dirigir la transcripción de una secuencia codificadora en una célula vegetal. Por tanto, los promotores usados en las construcciones de la invención incluyen elementos de control transcripcional que actúan en cis y secuencias reguladoras que están implicadas en regular o modular la sincronización y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control transcripcional que actúa en cis, incluyendo un activador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones en 5'... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de una planta resistente al estrés por sequía, que comprende:

(a) Transformar una población de plantas con una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia que es idéntico, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº :1, ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa; y (b) seleccionar una planta que es resistente al estrés por sequía.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de transformación se realiza usando Agrobacterium.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el promotor SARK es de Phaseolus vulgaris.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la isopentenil-transferasa es de Agrobacterium.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la isopentenil-tranferasa es idéntica al menos en un 95% a SEQ ID Nº :3.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta es una dicotiledónea.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la planta es tabaco.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la planta es monocotiledónea.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la planta es del género Or y za.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la planta es de uno de los siguientes géneros: Asparagus, Atropa, Avena, brassica, Citrus, Citrullus capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Festuca, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Or y za, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna y Zea.

11. Uso de una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia, que es idéntico, al menos en un 95%, al promotor de SEQ ID Nº :1 ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa, para preparar una planta resistente al estrés por sequía.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que el promotor SARK es tal y como se define en la reivindicación 3.

13. Uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que la secuencia de ácido nucleico es según se define en la reivindicación 4 ó 5.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la planta es según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

FIG. 1

días de deshidratación 7 días de deshidratación FIG. 1 (Cont.)

16 días de rehidratación

8 días de rehidratación

FIG. 2

7 días de sequía

18 días de sequía

7 días de rehidratación

14 días de rehidratación