MÉTODO PARA PRODUCIR SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO.

La presente divulgación se refiere al campo de la detección molecular de secuencias diana de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN genómico). Más concretamente, la presente divulgación se refiere a las sondas de ácido nucleico que forman una o más redes detectables en la secuencia diana, métodos para la producción de la sonda y métodos para su uso. En algunas realizaciones, las sondas divulgadas están sustancialmente libres de secuencia de ácido nucleico repetitiva. ANTECEDENTES Las técnicas de citogenética molecular, como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación cromogénica in situ (C1SH) y la hibridación con plata in situ (SISH), combinan la evaluación visual de los cromosomas (análisis cariotípico) con las técnicas moleculares. Los métodos de la citogenética molecular se basan en la hibridación de una sonda de ácido nucleico con su ácido nucleico complementario dentro de una célula. Una sonda para una región cromosómica específica reconocerá y se hibridará con su secuencia complementaria en un cromosoma en metafase o dentro de un núcleo en interfase (por ejemplo, en una muestra de tejido). Se han desarrollado sondas con diversos fines de diagnóstico e investigación. Por ejemplo, determinadas sondas producen un diagrama de bandas en los cromosomas que imita los procedimientos de teñido citogenético tradicionales y permite la identificación de cromosomas individuales para el análisis cariotípico. Otras sondas se obtienen de un único cromosoma y cuando están etiquetadas se pueden utilizar como «pinturas del cromosoma» para identificar cromosomas específicos dentro de una célula. Sin embargo, otras sondas identifican estructuras del cromosoma particulares, como los centrómeros o telómeros de los cromosomas. Las sondas de una secuencia única se hibridan con secuencias de ADN de copia única en un gen o una región cromosómica específica. Estas son las sondas empleadas para identificar el gen o la región crítica cromosómica asociada con un síndrome o condición de interés. En los cromosomas en metafase, estas sondas se hibridan con cada cromátida, normalmente dando dos pequeñas señales discretas por cromosoma. La hibridación de sondas de secuencia única ha hecho posible la detección de anomalías cromosómicas asociadas con numerosas enfermedades y síndromes, incluyendo anomalías genéticas constitutivas, como los síndromes de microdeleción, translocaciones cromosómicas, síndromes de aneuploidía y amplificación genética, enfermedades neoplásicas, así como infecciones patógenas. Más frecuentemente, estas técnicas se aplican a preparaciones citogenéticas estándar en los portaobjetos de los microscopios. Por otra parte, estos procedimientos se pueden utilizar en portaobjetos de tejido fijado en formalina, sangre o frotis de médula espinal, y células fijadas directamente u otros aislados nucleares. Por ejemplo, estas técnicas se utilizan frecuentemente para caracterizar células tumorales, tanto para los fines del diagnóstico como del pronóstico del cáncer. Numerosas anomalías cromosómicas han sido asociadas con el desarrollo del cáncer (por ejemplo, aneuploidías, como la trisomía 8, asociadas con determinados trastornos mieloides; translocaciones, como el reordenamiento BCR/ABL, en la leucemia mielógena crónica; y amplificaciones de secuencias de ácido nucleico específicas asociadas con la transformación neoplásica). Las técnicas moleculares pueden aumentar las pruebas citogenéticas estándar en la detección y caracterización de estas anomalías cromosómicas adquiridas. Por ejemplo, la FISH se ha utilizado para buscar el relapso temprano y la enfermedad residual de células que no se dividen. La detección inmunocitoquímica de las células cancerosas y las técnicas de FISH se han combinado para estudiar las anomalías cromosómicas en poblaciones de células definidas. La presente divulgación proporciona sondas y métodos mejorados para la producción de estas sondas para su uso en aplicaciones de diagnóstico e investigación de la hibridación in situ. RESUMEN La presente divulgación se refiere a las sondas de ácido nucleico y métodos para su uso y producción. Las sondas corresponden a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana de ARN o genómico) y son adecuadas para el análisis molecular de esta(s) diana(s), por ejemplo, los métodos de hibridación in situ, como FISH, CISH y SJSH. En determinados ejemplos, las sondas divulgadas ofrecen una mayor sensibilidad y especificidad, y una menor señal de fondo, en comparación con las sondas convencionales. Las sondas se proporcionan en la presente solicitud. En un ejemplo, una sonda de ácido nucleico incluye una pluralidad de moléculas de ácido nucleico. Prácticamente toda la pluralidad de las moléculas de ácido nucleico incluye al menos una primera región de unión y una segunda región de unión, donde la primera región de unión y la 2 5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  segunda región de unión son porciones contiguas y complementarias de las porciones no contiguas y secuencias únicas de una molécula de ácido nucleico diana. De este modo, las regiones de unión se pueden posicionar en la pluralidad de las moléculas de ácido nucleico de forma que el orden y/o la orientación de las regiones de unión sean diferentes del orden y la orientación de las regiones de unión de la secuencia diana. Por tanto, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se denomina en el presente moléculas de ácido nucleico fragmentadas, permutadas, concatenadas (FPC). En determinados ejemplos, las regiones de unión están sustancialmente libres de la secuencia no deseada, como las secuencias que resultan en una unión no específica aumentada de una sonda de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico repetitivas encontradas en secuencias de ácido nucleico diana del genoma de los mamíferos, secuencias que codifican dominios conservados en secuencias diana de ARN, o secuencias homólogas en secuencias de ácido nucleico de genomas virales diana). La pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede ser etiquetada, produciendo así una sonda etiquetada. En un ejemplo, la pluralidad de ácido nucleico está etiquetada utilizando la traslación por muescas, fragmentando así la pluralidad de moléculas de ácido nucleico, donde las moléculas fragmentadas se pueden utilizar como una sonda. En algunos ejemplos, la sonda incluye una pluralidad heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Prácticamente toda la pluralidad heterogénea de moléculas de ácido nucleico incluye al menos una primera región de unión con una primera secuencia de nucleótido y una segunda región de unión que cuenta con una segunda secuencia de nucleótido. La primera región de unión y la segunda región de unión son porciones contiguas y complementarias de las porciones no contiguas y secuencias de nucleótidos únicas de la molécula de ácido nucleico diana. La primera secuencia de nucleótido y la segunda secuencia de nucleótido de cada pluralidad de moléculas de ácido nucleico pueden diferir de la primera secuencia de nucleótido y la segunda secuencia de nucleótido en otras pluralidades de moléculas de ácido nucleico. También se divulgan métodos para producir las sondas de la presente divulgación, así como sondas producidas por el método. En un ejemplo, las sondas se producen por un método que incluye la unión al menos de una primera región de unión y una segunda región de unión, produciendo así una pluralidad de moléculas de ácido nucleico. Prácticamente toda la pluralidad de moléculas de ácido nucleico incluye al menos una primera región de unión y una segunda región de unión contiguas, donde al menos la primera región de unión y la segunda región de unión contiguas son complementarias de las porciones no contiguas y secuencias únicas de la molécula de ácido nucleico diana. En determinados ejemplos, las regiones de unión están sustancialmente libres de la secuencia no deseada presente en la secuencia diana, tales como secuencias que resultan en un aumento de la unión no específica de una sonda de ácido nucleico a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico repetitivas encontradas en secuencias de ácido nucleico diana del genoma de los mamíferos, secuencias que codifican dominios conservados en secuencias diana de ARN, o secuencias homólogas en secuencias de ácido nucleico de genomas virales diana). La pluralidad resultante de moléculas de ácido nucleico forma la sonda. El método también puede incluir la amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico para producir una pluralidad de amplímeros de moléculas de ácido nucleico para formar la sonda.... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una sonda de ácido nucleico que comprende: la identificación de secuencias de ácido nucleico repetitivas de una molécula de ácido nucleico diana; la generación al menos de una primera región de unión y una segunda región de unión donde al menos la primera región de unión y la segunda región de unión están sustancialmente libres de secuencias de ácido nucleico repetitivas de la molécula de ácido nucleico diana, y la unión de al menos la primera región de unión y la segunda región de unión en una orientación y un orden aleatorios, produciendo así una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, en la que sustancialmente todas las moléculas de ácido nucleico comprenden al menos una primera región de unión y una segunda región de unión contiguas, donde la primera región de unión y la segunda región de unión contiguas son complementarias de las porciones no contiguas y secuencias únicas de la molécula de ácido nucleico diana, y donde la pluralidad de moléculas de ácido nucleico forma la sonda. 2. El método de la reivindicación 2, que comprende asimismo:la amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico para producir una pluralidad de amplímeros de la molécula de ácido nucleico para formar la sonda, preferiblemente comprendiendo también el etiquetado de la pluralidad de amplímeros de la molécula de ácido nucleico, para producir una sonda etiquetada, preferiblemente en la que la pluralidad de amplímeros de la molécula de ácido nucleico está etiquetada utilizando la traslación por muescas. 3. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ácido nucleico diana es de un genoma eucariótico o viral, o de una molécula de ARN. 4. El método de la reivindicación 1, donde al menos la primera región de unión y la segunda región de unión se generan: (a) aislando al menos la primera región de unión y la segunda región de unión de la molécula de ácido nucleico diana; (b) obteniendo al menos la primera región de unión y la segunda región de unión de la molécula de ácido nucleico diana mediante hibridación sustractiva; (c) amplificando al menos la primera región de unión y la segunda región de unión de la molécula de ácido nucleico diana; o (d) cualquier combinación de (a), (b) y (c). 5. El método de la reivindicación 1, donde al menos la primera región de unión y la segunda región de unión son aisladas o amplificadas de una molécula de ácido nucleico diana presente en un vector. 6. El método de la reivindicación 1, que comprende asimismo:la generación y amplificación de una pluralidad de regiones de unión que están sustancialmente libres de secuencias de ácido nucleico repetitivas de una secuencia de ácido nucleico diana para producir una pluralidad de amplímeros de la región de unión; la unión de la pluralidad de los amplímeros de la región de unión para producir una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, en la que sustancialmente todas las moléculas de ácido nucleico comprenden regiones de unión contiguas que son complementarias de las porciones no contiguas y secuencias únicas de una molécula de ácido nucleico diana. la amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico para producir una pluralidad de amplímeros de la molécula de ácido nucleico; y el etiquetado de la pluralidad de amplímeros de la molécula de ácido nucleico para producir la sonda. 99           FIG. 1B 101     102     103     104         106     107     108     109