MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE NOR-TRITERPENOS METILEN-QUINONAS A PARTIR DE CULTIVOS IN VITRO DE EXPLANTES DE MAYTENUS CANARIENSIS.

Método de producción de nor-triterpenos metilen-quinonas a partir de cultivos in vitro de plantas.

La presente invención se refiere a un método de cultivo in vitro de explantes de plantas germinadas a partir de semillas, y/o de explantes de plantas nativas preferentemente de Maytenus canariensis para incrementar la producción de nor-triterpenos metilen-quinonas a partir de cultivos en suspensión de las líneas celulares extraídas de dichos explantes. Además la presente invención demuestra la influencia de los medios de cultivo así como el tratamiento con diferentes elicitores en el incremento en la producción in vitro de nor-triterpenos metilen-quinonas.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200900497.

Solicitante: CENTRO ATLANTICO DEL MEDICAMENTO, S.A.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: SANTA CRUZ DE TENERIFE.

Inventor/es: Hildebrandt,Ina, GUTIERREZ RAVELO,ANGEL DOMINGO.

Fecha de Solicitud: 23 de Febrero de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 23 de Diciembre de 2011.

Clasificación PCT:

  • A01G7/06 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01G HORTICULTURA; CULTIVO DE LEGUMBRES, FLORES, ARROZ, FRUTOS, VID, LUPULO O ALGAS; SILVICULTURA; RIEGO (recolección de frutas, verduras, lúpulo o productos similares A01D 46/00; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; dispositivos para desmochar o pelar las cebollas o bulbos de flor A23N 15/08; crecimiento de algas unicelulares C12N 1/12; cultivo de células vegetales C12N 5/00). › A01G 7/00 Botánica en general (cultivo sin tierra A01G 31/00). › Tratamiento de los árboles o de las plantas durante su crecimiento, p. ej. para prevenir la descomposición de la madera, para colorear las flores, la madera, para prolongar la vida de las plantas.
  • A01H4/00 A01 […] › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos.
  • A61K36/37 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 36/00 Preparaciones medicinales de constitución indeterminada que contienen sustancias procedentes de algas, líquenes, hongos o plantas o sus derivados, p. ej. medicinas tradicionales basadas en plantas. › Celastraceae (familia de la falsa ducarama), p. ej. tripterygium o bonetero.

PDF original: ES-2352491_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de producción de nor-triterpenos metilen-quinonas a partir de cultivos in vitro de explantes de plantas.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método de producción de nor-triterpenos metilen-quinonas, a partir de cultivos in vitro de plantas o partes de las mismas preferentemente de la familia Celastraceae. Por lo tanto, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la ingeniería genética y la fisiología vegetal. Al ser los nor-triterpenos metilen-quinonas utilizados en el campo farmacéutico, la presente invención también se adscribe a este sector.

Estado de la técnica

Los triterpenos son moléculas sintetizadas por diferentes especies de plantas. Forman parte de una amplia y diversa familia de metabolitos secundarios conocidos como terpenoides. (Dewick PM, 2002). Los triterpenos formados por seis unidades de isoprenos que responden a la fórmula molecular C30H48, se les conoce con el nombre de triterpenoides.

Los triterpenos ejercen importantes actividades biológicas con un gran interés farmacológico y médico. Estas actividades comprenden por ejemplo:

• protección microvascular frente al incremento de la permeabilidad vascular en conejos, llevada a cabo por los triterpenos taraxasto-20-ene-3a-ol y taraxast-12, 20(30)-dien-3a-ol (Pérez-Gutiérrez et al., 2007).

• propiedades antioxidantes, anti- y pro-inflamatorias y anticancerígenas atribuidas al ácido ursólico, un ácido carboxílico pentacíclico triterpenoide natural (Ikeda et al., 2008).

• propiedades anti-fatiga (Zhang et al., 2006).

• propiedades neuroprotectoras frente a la toxicidad inducida por glutamato en cultivos primarios de células corticales de rata, atribuidas a las saponinas triterpenoides (Son et al., 2007).

• actividad anti-VIH de la dimetilsuccinil-betulina (Kashiwada et al., 2001).

• actividad antituberculosa de los triterpenos obtenidos de Lippia turbinata (Waechter et al., 2001).

• actividad anti-malárica del ácido betulínico (Bringmann et al., 1997).

De particular interés en esta invención son los nor-triterpenos metilen-quinonas, particularmente la 22β-hidroxitingenona y la tingenona, así como sus moléculas relacionadas de naturaleza triterpénica (triterpenos pentacíclicos con dobles enlaces presentes en el anillo B, 20-hidroxitingenona y diversos fenol triterpenos quinonas). Estos nor-triterpenos metilen-quinonas también poseen importantes propiedades medicinales:

• Interaccionan con el ADN e inhiben la polimerización de la tubulina, lo que les proporciona actividad antimitótica (Campanelli et al., 1980; Morita et al., 2008).

• Actividad antiprotozoica, frente a Giardia intestinalis, de la tingenona y la pristimerina, presentando unos valores de IC50 de 0,11 μM y 0,74 μM respectivamente, comparados con la metronidazola, fármaco comúnmente utilizado para combatir dicha infección y que presenta un valor de IC50 de 1,23 μM (Mena-Rejón et al., 2007).

• Actividad antitripanosómica de la tingenona frente al agente causante de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzy, inhibiendo el crecimiento de dicho parásito (Liao et al., 2008).

• Inhibición del crecimiento de Crithidia fasciculata, por parte de la tingenona, aunque de una manera menos eficiente que en el caso de los otros microorganismos antes mencionados (Goijman et al., 1985).

• Actividad insecticida de la tingenona, pristimerina y 20α-hidroxitingenona frente a Cydia pomonella (Avila et al., 2000).

Cabe destacar también que los principales nor-triterpenos metilen-quinonas de la presente invención, 22β-hidroxitingenona y tingenona, presentan actividad antibiótica frente a bacterias Gram (+) (González et al., 1997; 1998; Sotanaphun et al., 1999), actividad citotóxica gracias a su capacidad de interaccionar con las moléculas de ADN y ARN (González et al., 1993; 1997), actividad citotóxica in vitro, demostrada frente a líneas celulares cancerígenas, en particular, las líneas Hep-HG2 (línea celular de hepatocarcinoma humano), H-4-IIE (línea celular de hematoma de rata) y SK-Mel-28 (línea celular de melanoma humano) (Setzer et al., 1998; 2001; Lee et al., 2004). Además, la 22β-hidroxitingenona y la tingenona ejercen actividad anti-inflamatoria, gracias a su propiedad de inhibir la síntesis de citoquinas proinflamatorias del tipo IL-1β, y actividad antioxidante, al ser capaces de secuestrar los radicales libres de oxígeno (Jeller et al., 2004).

En la naturaleza, estos nor-triterpenos metilen-quinonas suelen obtenerse en pequeñas cantidades, principalmente, a partir de la corteza de raíces de árboles de la familia Celastraceae de aproximadamente 10-15 años de edad. Las concentraciones obtenidas de dichos metabolitos extraídos de la corteza de raíces de plantas, preferentemente Muytenus canariensis, son muy bajas, alrededor de 0,006% (w/w) para la tingenona, y 0,0005% (w/w) para la 22β-hidroxitingenona, exhibiendo una proporción aproximada de 11:1 respectivamente (González et al., 1996). En la corteza de raíces de Hippocratea excelsa, la concentración obtenida de tingenona fue aún menor que en el ejemplo anterior, 0,00036% (w/w), no obteniéndose concentración alguna de 22β-hidroxitingenona (Mena-Rejón et al., 2007). Otros estudios realizados en muestras de corteza de raíces de plantas de la familia Hippocrateaceae, como por ejemplo Cheiloclinium agnatum, han demostrado que las concentraciones obtenidas de este tipo de triterpenos varían desde los porcentajes antes citados hasta 0,0049% para la tingenona y 0,0018% para la 22β-hidroxitingenona (Jeller et al., 2004). Todos estos estudios evidencian la escasa concentración obtenida de estos metabolitos secundarios en la naturaleza.

Existen estudios en los que se han medido las concentraciones obtenidas de tingenona y 22β-hidroxitingenona en cultivos in vitro de callos y de células en suspensión obtenidas de los mismos de M. buchananii obteniéndose unos rendimientos del 0,005% para ambos metabolitos (Kutney et al., 1981). Del mismo modo, similares rendimientos, 0,0044% para tingenona y 0,041% para 22β-hidroxitingenona, fueron descritos para cultivos de callos de M. ilicifolia (Filho et al., 2004).

Las plantas son una importante fuente de alimentos y de suministro de materiales. Diferentes sustancias químicas, sintetizadas y acumuladas en las plantas, han servido a la humanidad como fármacos, perfumes, colores, colorantes, potenciadores del sabor, pegamentos, venenos, etc. La gran mayoría de los compuestos que proporcionan estas propiedades son los denominados metabolitos secundarios, siendo en su mayoría explotados por el ser humano debido a sus propiedades. Hay alrededor de 180.000-200.00 metabolitos secundarios conocidos, y aproximadamente 4.000 nuevas moléculas son descubiertas y aisladas cada año. Uno de los grupos más numerosos es el de los terpenoides, donde se conocen alrededor de 40.000-50.000 estructuras, seguido por el grupo de los alcaloides (Chapman y Hall, 2000). Se estima que alrededor del 40% de los actuales medicamentos en uso son de origen natural, ya sea como productos naturales tal cual (sin ningún tipo de manipulación química) o como derivados de los mismos. La Organización Mundial de la Salud estima que el 80% de la población mundial utiliza la medicina tradicional o popular como medio para el tratamiento de las enfermedades (Farsworth et al., 1985 y Newman et al., 2000).

Las fuentes de producción de metabolitos secundarios son principalmente de origen natural, aunque con los avances en química orgánica e ingeniería genética, la síntesis de algunas de estas moléculas ha alcanzado y, en algunos casos, se ha convertido en explotación comercial. La sobreexplotación de las plantas y los árboles, los cambios ambientales, la contaminación, las prácticas agrícolas de cultivo, la climatología, etc., influyen en los rendimientos de producción de estos metabolitos por parte de las plantas. En este sentido, existe una creciente demanda para establecer técnicas de cultivos in vitro y sistemas que garanticen una producción y suministro continuo de metabolitos secundarios de interés para el hombre. Esta alternativa presenta... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de producción de nor-triterpenos metilen-quinonas mediante cultivo in vitro de plantas que comprende los siguientes pasos:

a) Esterilización e inducción del crecimiento in vitro de semillas y/o explantes derivados de plantas nativas.

b) Cultivo in vitro de plantas derivadas de la germinación de las semillas y/o explantes.

c) Inducción de la formación de:

c1) callos en plantas cultivadas in vitro, en medios de cultivo apropiados

c2) raíces en cabellera en explantes o en plantas cultivadas in vitro, mediante la infección guiada con bacterias A. rhizogenes, en medios de cultivo apropiados.

d) Cultivo in vitro en suspensión de las líneas celulares y/o agregados celulares, derivados del crecimiento de los callos o las raíces en cabellera del paso c) en medios de cultivo apropiados.

e) Estimulación de los cultivos celulares y/o agregados celulares en suspensión del paso d).

f) Extracción de nor-triterpenos metilen-quinonas presente tanto en los medios nutritivos líquidos como en los propios cultivos celulares del paso d).

g) Medida de la concentración de los nor-triterpenos metilen-quinonas del apartado f).

2. Método según la reivindicación 1 dónde los medios de cultivo utilizados comprenden una fuente de carbono, específicamente sacarosa, fructosa y/o glucosa en una proporción del 1-10% (w/v).

3. Método según la reivindicación 2 caracterizado porque los medios de cultivo utilizados son B5 y MS.

4. Método según la reivindicación 2 caracterizado porque los medios de cultivo están suplementados con 2,4-D, NAA y BAP.

5. Método según la reivindicación 1 dónde los nor-triterpenos metilen-quinonas se seleccionan entre: triterpenos pentacíclicos con dobles enlaces presentes en el anillo B, 20-hidroxitingenona y diversos fenol triterpenos quinonas.

6. Método según la reivindicación 1 dónde los nor-triterpenos metilen-quinonas son preferentemente tingenona y 22β-hidroxitingenona.

7. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende el tratamiento de los cultivos de raíces en cabellera del paso c.2) con antioxidantes y antibióticos.

8. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque los antioxidantes utilizados son: PVPP o PVP o DTT.

9. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque los antibióticos utilizados son tetraciclina y cefotaxima.

10. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque las líneas celulares derivadas de los cultivos de callos del paso d) son preferentemente 1LD y 3COT.

11. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los estimuladores utilizados en el paso g) se seleccionan entre: Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora parasitica, Pythium sp., extracto de levadura, ácido salicílico, ácido acetil salicílico, etanol, quitosano y metil jasmonato.

12. Método según la reivindicación 11 caracterizado porque el estimulador utilizado preferentemente es metil jasmonato a una concentración que varía entre 0,1-2 mM, preferentemente 0,1 y 0,5 mM.

13. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el tiempo de tratamiento con los estimuladores de los cultivos in vitro del paso g) varía de 4-72 h, preferentemente 6 y 24 h.

14. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los explantes utilizados proceden de hojas y cotiledones.

15. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque las plantas son de la familia Hippocrateaceae o Celastraceae.

16. Método según la reivindicación 15 caracterizado porque las plantas de la familia Celastraceae pertenecen preferentemente a la especie Maytenus canariensis.


 

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