Un procedimiento para medir electroquímicamente 1,5-anhidroglucitol en una muestra de sangre completa,

que comprende las etapas de: eliminación o conversión de la glucosa y/o un derivado de la misma en la muestra de sangre completa que interfiere con la medición, sin separar las células sanguíneas en la muestra de sangre completa, permitir que actúe una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol sobre el 1,5-anhidroglucitol de la muestra de sangre completa, sin separar las células sanguíneas; y medición electroquímica del 1,5-anhidroglucitol.

Procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol en sangre completa.

Campo tecnico La presente invención se refiere a un procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol en sangre que esta sujeto a interferencia por glucosa y/o un derivado de la misma, concretamente, un procedimiento para medir electroquímicamente 1, 5-anhidroglucitol en sangre, caracterizado por que como muestra se utiliza sangre completa, y no es necesario separar las celulas sangufneas, se describe adicionalmente una microplaca detectora utilizado para la medición, y un kit para medir 1, 5-anhidroglucitol que incluye la microplaca detectora .

Tecnica anterior

En los ultimos anos, el numero de pacientes diabeticos ha ido en aumento a medida que la dieta se ha vuelto mas rica. Para evitar complicaciones en los pacientes diabeticos, los niveles de azucar en sangre deben mantenerse en niveles cercanos a los de los individuos sanos, y se utilizan ampliamente dispositivos para la automedición de los niveles de azucar en sangre de manera que los propios pacientes puedan monitorizar los niveles de azucar en sangre en sus hogares. Sin embargo, puesto que los niveles de azucar en sangre varfan dependiendo de la comida, y la medición tiene que hacerse con frecuencia, los pacientes sufren una pesada carga. Tambien es diffcil para los pacientes interpretar correctamente los valores medidos debido a la falta de conocimiento, y no resulta facil controlar rigurosamente los niveles de azucar en sangre. Mientras, puesto que el 1, 5-anhidroglucitol no se ve afectado por la comida y refleja el control de azucar en sangre en pacientes diabeticos durante la ultima semana, los pacientes diabeticos pueden entender correctamente su control de azucar en sangre mediante una medición "una vez por semana" solos en casa. Un kit de automedición de 1, 5-anhidroglucitol proporcionarfa una gran ventaja a los pacientes, pero los procedimientos convencionales para medir 1, 5-anhidroglucitol utilizando suero o plasma como muestra requieren la separación de las celulas sangufneas y no son adecuados para la automedición porque la medición requiere una gran cantidad de muestra. Por lo tanto, no se han creado kits de automedición de 1, 5-anhidroglucitol, que incluyen aquellos que utilizan como muestra una cantidad traza de sangre completa tal cual. Los procedimientos de medición de 1, 5-anhidroglucitol descritos en los documentos de patente 1 a 9 utilizan suero o plasma como muestra, no sangre completa, y no implican la medición electroquímica.

Ademas, cuando se utiliza una muestra de sangre completa para el kit de 1, 5AG para animales (Nippon Kayaku Co., Ltd.) distribuido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., la sangre se hemoliza anadiendo agua purificada o una solución acuosa de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 10 mM y se centrifuga adicionalmente, el sobrenadante se trata con una columna, y el 1, 5-anhidroglucitol se mide mediante un procedimiento colorimetrico que utiliza un pigmento. En otras palabras, este procedimiento no es un procedimiento para medir electroquímicamente 1, 5-anhidroglucitol utilizando como muestra sangre completa tal cual, sin separar las celulas sangufneas. La razón para utilizar convencionalmente suero o plasma como muestra, no sangre completa, es que la glucosa tambien esta contenida en las celulas sangufneas. Incluso cuando se anade un reactivo a la sangre completa para 45 eliminar o convertir la glucosa, la glucosa permanece en las celulas sangufneas sin ser eliminada o convertida. Puesto que la glucosa se libera a traves de la membrana celular en la etapa de medición de 1, 5-anhidroglucitol en sangre, no puede eliminarse completamente la interferencia producida por la glucosa. En una reacción para detectar 1, 5-anhidroglucitol en sangre, se espera una interferencia producida por la hemoglobina en los eritrocitos con capacidad de oxidación-reducción. Hasta ahora, no se conoce un procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol en sangre que utilice sangre completa convirtiendo o eliminando enzimaticamente la glucosa con antelación, sin separar las celulas sangufneas. Ademas, los procedimientos para medir electroquímicamente 1, 5-anhidroglucitol se describen en el DOCUMENTO NO PATENTE 1 y en los DOCUMENTOS DE PATENTE 10 y 11. Sin embargo, el DOCUMENTO NO PATENTE 1

55 describe un procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol en orina utilizando un detector enzimatico compuesto de un electrodo de peróxido de hidr6geno y una membrana con enzimas inmovilizadas. Sin embargo, no se menciona la medición de 1, 5-anhidroglucitol en sangre completa, en la que coexisten glucosa y similares. En el DOCUMENTO DE PATENTE 10, el 1, 5-anhidroglucitol se mide por amperometrfa utilizando una deshidrogenasa y metosulfato de fenacina como aceptor de electrones. Sin embargo, sólo se mencionan ejemplos para el estandar de referencia del 1, 5-anhidroglucitol, y no existe ninguna descripción acerca de la medición en sangre completa. En el DOCUMENTO DE PATENTE 11, se deja actuar a una enzima con la capacidad de oxidar el 1, 5-anhidroglucitol, y se mide electroquímicamente el peróxido de hidr6geno producido utilizando un electrodo de peróxido de hidr6geno. Sin embargo, en esta medición tambien se utiliza suero, y este no es un procedimiento de medición que utilice sangre completa.

65 Mientras, el 1, 5-anhidroglucitol es un compuesto que es una glucosa reducida en la posición de 1 y tiene una estructura química muy similar a la de la glucosa. Por lo tanto, muchas de las enzimas utilizadas para medir 1, 5-anhidroglucitol tambien reaccionan con la glucosa. La glucosa en sangre es 20 veces mas abundante (o mas) que el 1, 5-anhidroglucitol. Por lo tanto, para medir 1, 5-anhidroglucitol, la glucosa debe eliminarse o convertirse de alguna manera para que la glucosa no reaccione con las enzimas para medir 1, 5-anhidroglucitol. Ademas, cuando los derivados de la glucosa producidos por esta conversión reaccionan con las enzimas para medir 1, 5-anhidroglucitol, estos derivados tambien deben eliminarse o convertirse.

En el DOCUMENTO DE PATENTE 1, la glucosa se elimina o se convierte por oxidación de la glucosa con glucosa oxidasa o por fosforilación de la glucosa con hexoquinasa, en el DOCUMENTO DE PATENTE 2 por oxidación de la glucosa con glucosa oxidasa y gluconolactonasa o glucosa deshidrogenasa y gluconolactonasa, en los DOCUMENTOS DE PATENTE 3 y 4 por conversión de la glucosa en fructosa-1, 6-difosfato con hexoquinasa, fosfohexosa isomerasa, y 6-fosfofructoquinasa o glucosa isomerasa, fructoquinasa, y 6-fosfofructoquinasa, en el DOCUMENTO DE PATENTE 5 por fosforilación de la glucosa con glucoquinasa o hexoquinasa, y en el DOCUMENTO DE PATENTE 6 por fosforilación de la glucosa con una enzima que fosforila la glucosa a glucosa-6-fosfato y, a continuación se mide el 1, 5-anhidroglucitol. En estos documentos, la glucosa se convierte en glucono-1, 5-lactona, glucosa-6-fosfato, acido glucónico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1, 6-difosfato, o similares. Hasta ahora, sin embargo, no se conoce la medición eliminando o convirtiendo la glucosa en sangre completa con una enzima y a continuación cuantificando electroquímicamente el 1, 5-anhidroglucitol en sangre completa con una enzima.

DOCUMENTO DE PATENTE 1: Patente japonesa nO 2983015 DOCUMENTO DE PATENTE 2: JP-A-2001-78797 DOCUMENTO DE PATENTE 3: Patente japonesa nO 3170320 DOCUMENTO DE PATENTE 4: Patente Japonesa nO 3217180

DOCUMENTO DE PATENTE 5: JP-A-2001-116756 DOCUMENTO DE PATENTE 6: Patente japonesa nO 2872983 DOCUMENTO DE PATENTE 7: JP-A-63-185397 DOCUMENTO DE PATENTE 8: JP-A-10-191998 DOCUMENTO DE PATENTE9: JP-A-8-70893 DOCUMENTO DE PATENTE 10: JP-A-7-67697 DOCUMENTO DE PATENTE 11: JP-A-62-79780 DOCUMENTO DE PATENTE 12: JP-A-5-304997 DOCUMENTO DE PATENTE 13: JP-A-63-22185 DOCUMENTO DE PATENTE 14: JP-A-2-268679

DOCUMENTO DE PATENTE 15: JP-A-2000-135079 DOCUMENTO DE PATENTE 16: JP-A-11-18760 DOCUMENTO DE PATENTE 17: JP-A-2000-175698 DOCUMENTO DE PATENTE 18: JP-A-10-179140 DOCUMENTO NO PATENTE 1: Biomed. Chromatogr., Vol.7, p.41 (1993)

Divulgacian de la invencian

Problemas a ser resueltos por la invención 45 Para las pruebas de laboratorio clfnico, recientemente se han implementado de manera creciente la medición rapida de diversos objetos de ensayo a pie de cama o en un centro de atención al paciente denominado Point of Care Testing y la medición de los niveles de azucar en sangre por los propios pacientes en el hogar. Puesto que en tales casos el uso de una centrffuga o similar para la obtención de suero o plasma resulta complicado y requiere tiempo, su uso en el entorno clfnico real resulta diffcil. En concreto, en la medición por los propios pacientes en casa,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para medir electroquímicamente 1, 5-anhidroglucitol en una muestra de sangre completa, que comprende las etapas de:

eliminación o conversión de la glucosa y/o un derivado de la misma en la muestra de sangre completa que interfiere con la medición, sin separar las celulas sangufneas en la muestra de sangre completa, permitir que actue una enzima para medir 1, 5-anhidroglucitol sobre el 1, 5-anhidroglucitol de la muestra de sangre completa, sin separar las celulas sangufneas; y medición electroquímica del 1, 5-anhidroglucitol.

2. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 1, en el que la enzima para medir 1, 5-anhidroglucitol es una oxidorreductasa.

3. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 2, en el que la oxidorreductasa es piranosa 15 oxidasa, L-sorbosa oxidasa, o 1, 5-anhidroglucitol deshidrogenasa.

4. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 3, en el que la oxidorreductasa se deriva de los generos Pseudomonas o Agrobacterium.

5. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el 1, 5-anhidroglucitol se mide electroquímicamente en presencia de un mediador redox.

6. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 5, en el que el mediador redox es una complejo de osmio, un compuesto de quinona, un compuesto de ferroceno, un compuesto de fenotiacina, un compuesto de fenoxacina, un compuesto de fenacina, un compuesto de indofenol, un compuesto de difenilamina, o un compuesto fen6lico.

7. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la glucosa y/o un derivado de la misma se convierte o se elimina de la muestra de sangre completa a medida que 30 utiliza una enzima, sin separar las celulas sangufneas.

8. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el 1, 5-anhidroglucitol se mide electroquímicamente en presencia de un estabilizador.

9. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 8, en el que el estabilizador es acido 2-sulfobenzoico o acido 3-sulfobenzoico.

10. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el 1, 5-anhidroglucitol se mide electroquímicamente por amperometrfa, coulometrfa, o voltametrfa cfclica. 40

11. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el 1, 5-anhidroglucitol se mide electroquímicamente utilizando un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1, 5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1, 5-anhidroglucitol y un mediador redox, y un contraelectrodo.

12. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 11, en el que el 1, 5-anhidroglucitol se mide electroquímicamente utilizando un electrodo diferencial.

13. El procedimiento para medir 1, 5-anhidroglucitol segun la reivindicación 12, en el que el electrodo diferencial es

50 un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1, 5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1, 5-anhidroglucitol y un mediador redox, un electrodo de trabajo para medir un blanco que contiene un mediador redox pero que no contiene una oxidorreductasa para medir 1, 5-anhidroglucitol, y un contraelectrodo.