MEDIO DE PRUEBA Y PROCEDIMIENTO CUANTITATIVO O CUALITATIVO PARA LA IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE MATERIALES BIOLÓGICOS EN UNA MUESTRA DE PRUEBA.

Medio de prueba y procedimiento cuantitativo o cualitativo para la identificación y diferenciación de materiales biológicos en una muestra de prueba Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a un medio de prueba y un procedimiento para la detección, cuantificación, identificación y/o diferenciación de materiales biológicos en una muestra que puede contener una pluralidad de diferentes materiales biológicos. Las bacterias son el factor causante de muchas enfermedades de los seres humanos, animales superiores y plantas, y se transmiten comúnmente por vehículos tales como agua, bebidas, alimentos y otros organismos. Las pruebas de estos vehículos potenciales de bacterias son de importancia fundamental y generalmente se basan en "organismos indicadores". Borrego et al., Microbiol. Sem. 13:413-426, (1998). Por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) es un miembro gram negativo de la familia Enterobacteriaceae que es parte de la flora intestinal normal de animales de sangre caliente, y su presencia indica contaminación fecal (por ejemplo, aguas residuales). Aunque la mayoría de las cepas de E. coli no son la verdadera causa de la enfermedad, su presencia es una fuerte indicación de la posible presencia de patógenos asociados con la enfermedad intestinal, tales como cólera, disentería y hepatitis, entre otras. En consecuencia, E. coli se ha convertido en el organismo indicador principal de contaminación fecal, y como resultado, cualquier procedimiento que diferencie e identifique E. coli a partir de otras bacterias es muy útil. Otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, denominados comúnmente "coliformes generales," especialmente los géneros Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella, también se considera que son organismos indicadores significativos para la calidad de agua, bebidas y alimentos. Por lo tanto, las pruebas para identificar y diferenciar coliformes generales a partir de E. coli también son muy útiles. Además, se ha demostrado que diversas especies del género Aeromonas no sólo son patógenos potenciales, sino que tienen una correlación con otros organismos indicadores (Pettibone et al., J. Appl. Microbiol. 85:723-730 (1998)). Los procedimientos de prueba actuales para identificar, separar y enumerar Aeromonas spp. de las Enterobacteriaceae muy similares han sido insuficientes y la mayoría de los procedimientos actuales que utilizan sustratos de enzimas no separan Aeromonas spp. de Enterobacteriaceae debido a sus perfiles bioquímicos casi idénticos. Cualquier procedimiento que depende de la identificación de coliformes generales por medio de un sustrato de ß-galactosidasa no diferencia Aeromonas spp. de coliformes generales ni elimina Aeromonas de la muestra por el uso de inhibidores específicos (antibióticos tales como cefsulodina). Brenner et al., Appl. Envir. Microbio. 59:3534-44 (1993). Éstos no diferencian, identifican ni enumeran Aeromonas junto con E. coli y coliformes generales. Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354(1998). Se necesitan procedimientos de prueba mejorados para identificar, separar y enumerar eficazmente tales tipos bacterianos, y hay una búsqueda continua de aparatos y procedimientos de prueba más rápidos, más precisos, más fáciles de usar y más versátiles en este área. Se han utilizado numerosos procedimientos de prueba para determinar, identificar y enumerar uno o más organismos indicadores. Algunos de estos procedimientos de prueba sólo indican la presencia o ausencia del microorganismo, mientras otros también intentan cuantificar uno o más de los organismos particulares en la muestra de prueba. Por ejemplo, se puede utilizar una prueba cualitativa denominada prueba de Presencia/Ausencia (o P/A), para determinar la presencia o ausencia de coliformes y E. coli en una muestra de prueba. Un medio de prueba que incluye el sustrato ßgalactosidasa O-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG), y se inocula el sustrato ß-glucuronidasa 4-metil-umbeliferil-ß- D-glucurónido (MUG), con la muestra de prueba. Para diferenciar los coliformes generales de E. coli, esta prueba se basa en el hecho de que generalmente todos los coliformes producen ß-galactosidasa, mientras que sólo E. coli produce también ß-glucuronidasa además de ß-galactosidasa. Si está presente cualquier coliforme (incluyendo E. coli), el medio de caldo se vuelve de color amarillo debido a la actividad de la enzima galactosidasa sobre el material de ONPG, provocando la liberación de un pigmento amarillo difusible. Si está presente E. coli, el medio de caldo demostrará una fluorescencia azul cuando se irradia con rayos ultravioleta, debido a la degradación del reactivo MUG con la liberación del colorante fluorogénico provocada por la producción de la enzima glucuronidasa. Estas reacciones son muy específicas, y permiten la presencia de ambos coliformes en general, así como que se identifique E. coli en una única muestra. Una desventaja de esta prueba es que no es directamente cuantitativa para cualquier tipo bacteriano, ya que ambos reactivos producen pigmentos reactivos. Una segunda desventaja es que se puede producir una reacción positiva falsa de coliformes si están presentes Aeromonas spp. en la muestra de prueba. Se ha demostrado que esto es posible incluso cuando hay inhibidores presentes para prevenir supuestamente que esto se produzca (Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998)). La prueba también requiere un equipo específico para la producción de los rayos ultravioleta. Además, esta prueba sólo se puede usar para detectar coliformes y E. coli. Otros microorganismos importantes, tales como la cepa E. coli 0157 que es glucuronidasa negativa, no se detectan, ni son otros microorganismos que no producen galactosidasa-glucuronidasa. Se ha usado el procedimiento de agar bilis y rojo violeta (VRBA) para determinar la cantidad tanto de coliforme como de E. coli en una muestra de prueba. El medio de prueba usado en este procedimiento incluye sales de bilis (para inhibir no-coliformes), lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Puesto que los coliformes (incluyendo E. coli) crecen en el medio, la lactosa se fermenta con la producción de ácido, y el rojo neutro en la zona de la colonia bacteriana se vuelve de color rojo ladrillo. Los resultados de esta prueba no siempre son fáciles de interpretar, y para determinar la presencia 2   de E. coli, que confirme las pruebas de seguimiento, tales como fermentación con caldo lactosado verde brillante, se debe realizar el crecimiento en caldo EC a 44,5ºC y la siembra sobre agar eosina y azul de metileno (EMBA). El procedimiento del filtro de membrana (MF) utiliza filtros de microporos a través de los que se hacen pasar las muestras de modo que las bacterias quedan retenidas sobre la superficie del filtro. Este procedimiento se usa más a menudo cuando las poblaciones bacterianas son muy pequeñas, y se necesita una muestra grande para obtener valores adecuados. Después, se coloca el filtro sobre la superficie de un medio elegido, se incuba, y las colonias bacterianas que crecen sobre el filtro de membrana se recuentan y se evalúan. Este procedimiento se usa ampliamente y proporciona buenos resultados cuando se combina con los reactivos y el medio adecuados. Una desventaja de este procedimiento es que es caro y consume mucho tiempo. Tampoco funciona bien con muestras sólidas, o muestras con recuentos particulados elevados. Se puede usar el procedimiento MF junto con el procedimiento inventivo descrito en esta solicitud. El procedimiento m-Endo también se usa para determinar la cantidad de E. coli y coliformes generales y es un procedimiento oficial aprobado por USEPA para someter a prueba la calidad del agua. El medio se usa comúnmente con un filtro de membrana y unidades de formación de colonias (CFU) de E. coli y coliformes generales crecen como colonias oscuras con un brillo metálico verde dorado. Debido a una tasa alta probada de errores falsos positivos, se deben confirmar las colonias típicas por la realización de pruebas adicionales. Standard Methods for the Examination of water and Wastewater, 20ª Edición, 9-10 y 9-60 (1998). Otras pruebas, tales como el número más probable (MPN), utilizan caldos que contienen lactosa (LST, BGLB, EC) para estimar las cantidades de coliformes generales y E. coli, pero también se ha demostrado que tienen tasas altas o error, así como que son complicadas y lentas para la producción de resultados. Evans et al., Appl. Envir. Microbiol. 41:130- 138 (1981). El reactivo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido (X-gal) es un compuesto de prueba conocido para identificar coliformes. Cuando actúa por la enzima ß-galactosidasa producida por coliformes, X-gal forma un precipitado azul índigo insoluble. X-gal se puede incorporar en un medio de nutriente tal como una placa de agar, y si está presente una muestra que contiene... [Seguir leyendo]

1. U medio de prueba adecuado para detectar, cuantificar o diferenciar coliformes generales, E. coli, Aeromonas spp. y Salmonella spp., comprendiendo dicho medio de prueba: un sustrato de ß-D-glucurónido, que forma un primer producto en presencia de E. coli; un sustrato cromogénico de -D-galactósido, que forma un segundo producto en presencia de la Salmonella; y un sustrato cromogénico de ß-D-galactósido, que forma un tercer producto en presencia de Aeromonas, teniendo cada uno de tales productos un color que es visualmente distinguible entre sí, dichos productos de dichos sustratos de -D-galactósido y ß-D-galactósido forman una combinación de colores en presencia de coliformes generales, de modo que los coliformes generales, E. coli, Aeromonas, y Salmonella son visualmente distinguibles entre sí, y caracterizado además, en el que dicho sustrato de ß-D-glucurónido y uno de cualquiera de dicho sustrato cromogénico de -D-galactósido o dicho sustrato cromogénico de ß-D-galactósido consiste en el mismo componente de color, pero en diferentes cantidades. 2. El medio de prueba de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de ß-D-glucurónido es 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-glucurónido y dicho sustrato de -D-galactósido es 5-bromo-4-cloro-3-indolil-- D-galactósido. 3. El medio de prueba de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho medio tiene una concentración de aproximadamente 125 mg/l de ß- D-glucurónido y 65 mg/l de -D-galactósido. 4. El medio de prueba de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que dicho sustrato de ß-D-glucurónido es 5yodo-3-indolil-ß-D-glucurónido. 5. El medio de prueba de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que dicho sustrato de ß-D-glucurónido es indoxil-ß-D-glucurónido. 6. El medio de prueba de la reivindicación 1, que incluye un segundo sustrato de ß-D-glucurónido que consiste en 4metilumbeliferil-ß-D-glucurónido. 32